dT-DNA插入位 点的相邻基因在野生型和bgl-D突变体之间的相对表达水平没有显著差异。基于运些结果， 假设0s03g0175800为负责bgl-D突变体的基因并将该基因称为BG1。用5'和3'RACE试剂盒克 隆BG1的全长cDNA。结果表明BG1全长cDNA为1162bp长并包含编码第330位氨基酸的933bp开 放阅读框(0RF)。蛋白质数据库的BLAST研究显示，BG1与来自其他高等植物的蛋白质具有相 似性。系统发育分析表明，BG1及其22个结构同源物可被分成两个子组:BG1双子叶植物特异 性组和BG1单子叶植物特异性组。
[0200] 在拟南芥中，有四种与BG1显示出高度序列相似性的类BG1蛋白，在水稻和拟南芥 中，BG1的N端和C端区中的一些残基是高度保守的（图16)。在单子叶植物中，BG1与来自短柄 草的化adi lg72920、来自玉米的GRMZM2G007134和GRMZM2G438606密切相关，表明BG1在整个 植物物种中是进化保守的。BGl可充当谷物颗粒尺寸的新型植物特异性调控子。
[0201] 通过实时PCR和启动子GUS测定来检测BG1的表达模式，结果显示，BG1在包括根、 茎、叶、叶銷和穗在内的所有组织中广泛表达。但它在幼穗(l-5cm长)和茎中高度表达，并且 表达水平随着穗成熟而逐渐降低。BG1PR0:GUS转基因植物的组织化学分析显示，在所检测 组织的维管组织中优先检测到GUS活性（图5)。
[0202] BG1基因的克隆：使用已知技术分离水稻基因组DNA。利用SiteFinding PCR方法， 基于热不对称交错PCR(TAIL-PCR)识别Bgl-D中的T-DNA插入序列的3'-侧区。用于 SiteFinding PCR的引物在表S2中列出。通过Invitrogen 5'和3'34〔6系统扩增861的全长 cDNA。
[020引 表S1. T1代转基因阳性和阴性植物的Bg 1-D表型测定
[0204] Bgl( + )和Bgl(-)分别代表Τι代转基因阳性和阴性植物。所列出的值均为平均值± 沈。
[0205]
[0206] 表S2.用于Site-Finding PCR和RACE的引物（SEQ ID Ν0:28-38,下表按连续顺序 列出）。
[0207]
[0208] RNA提取和定量实时RT-PCR:使用TRIzol试剂（Invitrogen)从各个水稻组织分离 总RNA。经RNase free面ase(Promega)处理之后，取化g RNA，使用寡核巧酸(肌）引物和AMV 逆转录酶（Promega)进行逆转录。通过使用SsoFast EvaGreen S叫e;rmix(Biorad)和Bio Rad CFX96实时PCR仪进行定量实时PCR(qRT-PCR)实验。使用水稻ACTINl基因（OsACTl)作为 内对照物。用于qRT-PCR中的基因特异性引物在表S3中列出。
[0209] 载体构建和植株转化：由野生型植株的cDNA来扩增BG1全长编码序列，并将其克隆 到pCAMBIA 2300肌动蛋白中，生成pCAMBIA 2300-肌动蛋白：BG1过表达构建体。将含有化b 天然启动子的3.化b基因组片段和具有3'UTR的整个BGl编码区克隆到pCAMBIA 2300载体 中，得到pCAMBIA 2300-ProBGl :BG1过表达构建体。为了生成BGl-RNAi构建体，使用先前所 述的方法扩增BG1编码序列的44化P基因特异性片段(SEQ ID ^:75)并将其克隆到9〔4181八 2300肌动蛋白载体中化in et al.，2012，Plant Physiol.158:451-464化in等人，2012年， 《植物生理学》，第158卷，第451-464页））。而在启动子-GUS测定中，则扩增BGl基因翻译起始 密码子的2-化基因组片段上游并将其克隆到PCAMBIA2391Z中。对于亚细胞定位，将BG1与由 35S启动子驱动的C端GFP标记进行框内融合。确认序列后，用已知的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法将所得的全部构建体转化到水稻基因组 中。然后将转基因植物转移至稻田，进行正常的生长和种子收获。用于载体构建的引物序列 在表S4中列出。 脚0] 表S3.用于实时PCR的引物(SEQ ID N0:39-64,下表按连续顺序列出了每个基因的 正向引物和反向引物）。
[0211]
[0213] 表S4.用于载体构建的引物。（SEQ ID NO: 65-74,下表按连续顺序列出了正向引 物和反向引物）
[0214] (带标记的序列指示酶裂解位点）。
[0215]
[0216] 组织学分析和显微镜观察：用光学显微镜(BX51;01ympus)分析颖壳的横截面。用 福尔马林:冰醋酸:70%乙醇（1:1:18)固定颖壳，然后在乙醇梯度溶液中进行脱水。将固定 的组织嵌入化raplast Plus片（憐片状切片石蜡KSigma)中，用超薄切片机切成10WI1厚的 节段，然后置于多聚赖氨酸涂片(Sigma)上，随后在二甲苯中脱蜡，充分再水合并干燥，之后 进行甲苯胺蓝染色，W便用光学显微镜观察。用Olympus stream软件测定颖壳的外薄壁组 织层中的细胞数和细胞面积。用扫描电镜(S-3000N;Hitachi)分析颖壳的纵向剖面，如前文 所述进行样品预处理化i et al.，2010，Cell Res.20:838-849(Li等人，2010年，《细胞研 究》，第20卷，第838-849页））。测量野生型和Bgl-D两者中的细胞长度。
[0217] 实例3-BG1是控制谷物颗粒尺寸的新型正向调控子
[0218] 为了进一步验证BG1作为谷物颗粒尺寸调控子的功能W及BG1的过表达对于增大 的谷物颗粒尺寸表型是否必要，我们用驱动BGlcDNA的表达载体在水稻ACTIN1启动子的控 制下转化野生型水稻。如图6所示，BG1过表达植株表现出各种程度的谷物颗粒尺寸增大表 型和穗伸长（图6A、B、C)。表型变化的大小与BG1表达水平明显相关（图抓）dBG1-过表达株系 的每1000粒重量显著增加，运是因为与野生型相比，转基因植物的谷物颗粒长度和谷物颗 粒宽度增大（图6E、F、G)。相反，用RNAi抑制BG1导致水稻中产生明显表型。植株高度更矮，穗 长和谷物颗粒尺寸大大减小（图7A、B、C、D)，从而导致其每1000粒重量低于野生型植株。（图 7F)。所有运些表型在一定程度上符合BG1在茎和穗中高度表达的结果。结论是，BG1为负责 bgl-D显性突变体的基因。此外，由花挪菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的表达OsBGl的经 转化野生型拟南芥(Col-0)表现出，拟南芥中OsBGl的过表达还导致种子尺寸增大，运表明 OsBGl可在单子叶植物和双子叶植物之间共享某些共同的调控机制（图17)。
[0219] 实例4-定位于质膜的BG1
[0220] 为了研究BG1对谷物颗粒尺寸调控的作用，探索了BG1的亚细胞定位。用先前所述 的基于网络的工具进行的预测显示，BG1蛋白不包含限定特定亚细胞定位或细胞外分泌的 推定序列基序。然后，将BG1的0RF与增强的绿色巧光蛋白（BGl-eGFP)融合，生成PC2300- 35S:BGl-eGFP载体。转基因植物显示出与bgl-D突变体相同的表型，诸如增大的谷物颗粒尺 寸和植株高度，运表明融合的BGl-eGFP与单独的BG1具有相同的功能。观察转基因幼苗的 根，BGl-eGFP的巧光主要定位于质膜（图8A)，运符合我们对水稻原生质体中的BGl-eGFP的 瞬时表达测定。为了进一步确认该结果，分离含有BGl-eGFP的转基因植物的微粒体，观察到 可通过微粒体颗粒中的GFP抗体来检测到BG-eGFP，但在可溶性级分中只检测到非常微弱的 信号。双相分配测定进一步确认，富含质膜的级分中高度富含BG1-GFP蛋白，但其他膜的级 分中则不含BG1-GFP蛋白（图8B)。所有运些结果表明，BG1为主要定位于质膜的新型蛋白质。
[0221] BG1的亚细胞定位：用eGFP蛋白在35S启动子的控制下对BGlcDNA序列进行框内克 隆。对于共聚焦显微镜法而言，通过使用激光共聚焦扫描显微镜化eica TCS SP5)对BG1: eGFP转基因株系的7天龄幼苗的根尖和水稻原生质体进行成像来检测BGl:eGFP的定位模 式。eGFP在488nm波长处被激发，发射滤波器为500-530nm。根据经过略微修改的先前所述的 方法（Zhang et al.，2011，Plant Methods 7.21(Zhang等人，2011 年，《植物方法》，第7卷， 第21页））进行水稻原生质体的制备和有效转染。根据先前所述的方案进行微粒体分馈和双 相膜分配实验。用SDS-PAGE分析全部微粒体和富含PM的上层相中的等量蛋白质，并用抗GFP (Roche)、抗PIP2(Agrisera)、抗阳PC(Agrisera)和抗LHCII(Agrisera)抗体进行免疫印迹。 帷。实例5-BGl是初级生长素应答基因
[0223]植物激素在植物的生长和发育中起到非常重要的作用。为了确定BG1是否能响应 于外源植物激素，在不同处理条件下通过实时PCR来研究BG1的相对mRNA水平。结果显示，在 施加2小时之后，BG1可被IAA特异性诱导，但不会被其他植物激素诱导（图9A)。野生型植株 中的时程IAA诱导显示，BG ImRNA水平在IAA施加的30分钟内快速提高，最高水平比4小时后 在未诱导植株中观察到的水平高大约8倍，然后表达下降并逐渐降至初始水平（图9B)。在蛋 白质合成抑制剂放线菌酬(CHX)的存在下发生BGlmRNA被IAA诱导，运表明BG1转录物的积聚 与蛋白质合成无关（图9C)。此外，另外两种生长素化合物，糞乙酸(NAA)和2,4-二氯苯氧乙 酸（2-4-D)也能诱导BG1的表达。然而，色氨酸（一种在结构上类似于IAA但不具有生长素活 性的分子)不能诱导BGlmRNA积聚（图9D)。运些结果均符合在BG1翻译起始位点上游1500bp 范围内发现两种生长素响应元件(TGTCTC)的情况。基于运些结果，预测BG1为新型初级生长 素应答基因。为了测试外源IAA的敏感性，用10-3μΜ IAA处理野生型和Bgl-D的7天龄幼苗的 叶銷，与野生型植株的叶銷相比，Bgl-D突变体表现出叶銷伸长，运表明BG1的活性导致IAA 敏感性提高（图9E)。
[0。4] 实例6-Bgl-D突变体表现出改变的IAA分布和传输
[0225] 为了进一步阐明负责由BG1过表达赋予的表型的机制，观察了提高的BG1活性对生 长素传输的影响。当DR5-GUS植株与Bgl-D杂交时，双突变体中的GUS表达模式改变。在野生 型植株中，GUS表达主要积聚在根尖区域处。然而，在DR5-GUS/Bgl-D双突变体中，GUS表达在 根伸长区更强烈并覆盖更大的面积（图10B)。此外，当直接测定向基部运输的IAA时发现，在 黑暗中生长的Bgl-D幼苗的胚芽銷中观察到向基部进行的IAA传输提高大约50%，运表明向 基部进行的PAT增强导致Bgl-D突变体植株中的内源IAA分布改变（图10A)。因此，Bgl-D表现 出对NPA(外源IAA传输抑制剂)增强的抗性，显示BG1能特异性地响应于IAA并伴随增强的极 性生长素传输(图18)。
[0226] 生长素传输测定：用黑暗中生长的水稻幼苗的5天龄胚芽銷进行极性生长素传输 测定，方法如先前所述但经过略微修改化i et al.，2007，Cell Res.l7,402-410(Li等人， 2007年，《细胞研究》，第 17卷，第402-410页）；Qi et al.，2008，Plant I%ysiol.l47，1947- 1959(Qi等人，2008年，《植物生理学》，第147卷，第1947-1959页））：将2.0cm长的顶端胚芽銷 片段(切掉距离尖端0.2cm)放入1/2MS培养基中，在50rpm下振摇2小时，进行预培养。然后将 胚芽銷片段的顶端浸入1.5mL微量离屯、管内的15化1/2MS液体培养基中，该培养基包含 0.2 %组培凝胶、500nM 3H-IAA和50化Μ游离IAA，在黑暗中于室溫下放置3小时。加入NPA和 3Η-ΒΑ，作为ΙΑΑ传输对照物。经过3小时传输测定后，从所述片段的未浸没端上切取0.5cm， 并用1/2MS液体培养基洗涂Ξ次。然后将所述片段分成五组，并在2.OmL通用闪烁液中溫育 1她。用液体闪烁计数器（1450Mic;roBeta Trixjerkin-Elmer)对放射性进行计量。基于浸 入缓冲液中的胚芽銷片段的取向，还测定了向顶生长素传输，W作为阴性对照。
[0。7] 实例7:器官尺寸相关基因在Bgl-D突变体中被上调
[02%]已确定一些基因的特征为控制拟南芥的器官尺寸，尤其是负责细胞增殖和细胞扩 张的基因，诸如AI肥GUMENTA(ANT)、AtEXP10、ARG0S、切cD3;l、AtGIF巧PAtGRFl。为了研究 BG1与调控水稻中植物细胞增殖和细胞扩张的基因之间的关系，使用定量RT-PCR来分析突 变体和野生型植株两者中核细胞周期和细胞扩张调控子的转录水平。与野生型植株相比， Bgl-D幼穗中的调控细胞周期的G1至SI阶段的基因和细胞扩张基因显著上调（图11)。运些 结果表明，BG1可通过调控生长素信号转导或传输在细胞增殖和细胞扩张的控制中发挥新 的正向调控作用。
[0229] 实例8-BG1的表达提高增加了生物量并提高了谷物颗粒产量
[0230] 由于bgl-D中BG1的激活导致谷物颗粒尺寸增大和谷物颗粒重量增加，因此测试通 过BG1过表达是否可提高生物量和谷物颗粒产量。在稻田中生长时，过表达BG1的转基因水 稻植株表现出成熟器官的干重显著增加。相比之下，两种独立的BGl-RNAi转基因植株(Ril 和化2)表现出生物量减小（图19)。为了避免BG1的异位过表达，我们用由其天然启动子驱动 的BG1基因组DNA过表达野生型植株中的BG1。与非转基因对照植株相比，过表达BG1的转基 因水稻表现出具有增大的谷物颗粒尺寸和更大的穗，但没有其他显著的罚分性状(图12A、B 和C)。转基因株系0E-5、0E-7的每1000粒重量分别增加了 15.48%和25.38%，单株谷物颗粒 产量分别提高了6.69%和16.65%。（图12D和E)。产量测试显示，BG1表达提高的植株的谷物 颗粒产量比日本晴提高了约15 %至20 % (表A2)。总体看来，运些结果证明水稻中的BG1过表 达与生物量的增加和谷物颗粒产量的提高呈正相关。
[0231] 蛋白质序列和系统发育分析:水稻和拟南芥的BG1序列分别得自水稻标注项目数 据库（http://rapdb.dna.aff;rc.go.jp/)和拟南芥信息资源（http:// WWW. arabidopsis . org/index. jsp)。使用ClustalX 1.83对蛋白质序列进行比对，并用 GeneDoc显示保守的残基化ttp: //www. nrbsc. org/gfx/genedoc/)。对于植株中的BG1同源 物的系统发育分析而言，通过国家生物技术信息中屯、（National Center for Biotechnology Informat ion, NCBI) BLAST研究获得总共23个独特的蛋白质序列，并用 Clus化1W程序进行比对。使用MEGA 4.0基于邻接法来构建系统发育树。利用500个平行测定 通过靴值分析来评估形貌稳定性。 脚。总体同一性（同一性％)-表2
[0233]空位形成罚分:8,空位延伸罚分:2
[02：34]_
[0237]~已结合各个具体的和优选的实施例和技术描述了本公开。然而，应当理解，在保持I 在本公开的实质和范围内的情况下可W作出许多变化和修改。
【主权项】
1. 一种改善植物的农学特性的方法，所述方法包括调节以下多核苷酸的表达：（i)编码 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1中的一者具有至少95%同一性的氨基酸 序列的多核苷酸，（ii)在严格的杂交条件下与包含SEQ ID NO: 2的多核苷酸的片段杂交的 多核苷酸，其中所述片段包含SEQ ID N0:2的至少100个连续核苷酸，（iii)编码与SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性的氨基酸序列的多核苷酸，（iv)编码多肽的多核苷酸，与SEQ ID NO: 1相比所述多肽包含氨基酸的一个或多个缺失或插入或替换。2. 根据权利要求1所述的方法，其中通过用可操作地连接至异源启动子的重组多核苷 酸转化所述植物来提高编码多肽的所述多核苷酸的表达，所述多肽与SEQ ID NO: 1具有至 少95%的同一性。3. 根据权利要求1所述的方法，其中通过上调与所述内源性多核苷酸可操作地结合的 调控元件的基因表达来提高编码多肽的内源性多核苷酸的表达，所述多肽与SEQ ID NO: 1 具有至少95%的同一性。4. 根据权利要求1所述的方法，其中通过在SEQ ID N0:3的调控元件的调控下表达所述 多核苷酸来提高所述多核苷酸的表达。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述农学特性选自：（i)谷物颗粒尺寸增大，（ii)谷 物颗粒重量增加，（iii)穗长增大，（iv)谷物颗粒产量提高，（v)籽粒灌浆速率提高，（vi)生 物量增加。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述农学性能为在营养生长期和/或生殖期中的植 物生物量的增加。7. 根据权利要求1所述的方法，其中相对于所述多核苷酸的表达未提高的对照植物，所 述谷物颗粒重量增加。8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是水稻或玉米。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是大豆。12. -种提高植物产量的方法，所述方法包括提高编码多肽的多核苷酸的所述表达，所 述多肽包含选自SEQIDN0:1、SEQIDN0 :4-SEQIDN0:27的氨基酸序列或它们的等位基 因变体。13. -种提高水稻颗粒产量的方法，所述方法包括表达编码多肽的多核苷酸，所述多肽 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其变体。14. 一种用于提高产量的植物标记辅助选择方法，所述方法包括： a. 进行植物的标记辅助选择，所述植物在编码蛋白质的基因组区域中具有一个或多个 变异，所述蛋白质包含SEQ ID NO: 1或其变体或其调控序列；以及 b. 识别表现出更高产量的所述植物。15. -种识别一组水稻植株中与谷物颗粒产量提高相关的一个或多个等位基因的方 法，所述方法包括： a.评估一组水稻植株中的下列区域中的一个或多个等位基因变异：（i)基因组区域，所 述基因组区域编码多肽或（ii)控制所述多肽的表达的所述调控区，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1具有95%同一性的序列； b.获得所述组中一个或多个水稻植株的提高的产量的表型值； C.将所述基因组区域中的所述等位基因变异与所述表型相关联；以及 d.识别与产量提高相关的所述一个或多个等位基因。16. -种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸（i)编码包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4-SEQ ID N0:27中的一者的氨基酸序列或与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27中 的一者具有至少95%同一性的氨基酸序列，（ii)在严格的杂交条件下与选自SEQ ID N0:2 的多核苷酸的片段杂交，其中所述片段包含SEQ ID N0:2的至少100个连续核苷酸，（iii)编 码与SEQ ID N0:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，（iv)编码多肽的多核苷酸，与SEQ ID NO: 1相比所述多肽包含氨基酸的一个或多个缺失或插入或替换，其中所述多核苷酸编码参 与谷物颗粒宽度、重量或产量调节的多肽。17. -种重组表达盒，所述重组表达盒包含根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述 多核苷酸可操作地连接至调控元件，其中所述表达盒在植物细胞中是有功能的。18. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求17所述的表达盒。19. 一种转基因植物，所述转基因植物包含根据权利要求18所述的重组表达盒。20. -种转基因植物部件，所述转基因植物部件包括植物调控元件，所述植物调控元件 可操作地调控编码多肽的多核苷酸的所述表达，所述多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列 或其变体或其同源物，其中所述调控元件与所述多核苷酸是异源的。21. 根据权利要求20所述的多核苷酸，其中调控所述表达的所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8的序列或其功能启动子片段。22. -种用于提高产量的玉米植物标记辅助选择方法，所述方法包括： a. 检测多个玉米植株中的基因组区域或调控序列中的一个或多个基因变异，所述基因 组区域包含编码选自SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 14的蛋白质或其变体的多核苷酸，所述调 控序列控制其所述多核苷酸的表达;以及 b. 将所述一个或多个变异与产量提高相关联，从而选择具有与更高产量相关的所述一 个或多个变异的所述玉米植株。23. -种识别一组玉米植株中与产量提高相关的一个或多个等位基因的方法，所述方 法包括： a. 评估一组玉米植株中的下列区域中的一个或多个基因变异：（i)编码多肽的基因组 区域或（ii)控制所述多肽的表达的调控区，其中所述多肽包含选自SEQ ID N0:12-SEQ ID NO: 14的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 14具有95%同一性的序列； b. 获得所述组中的一个或多个玉米植株的产量数据； c. 将编码所述多肽的所述基因组区域中的或控制所述多肽的表达的所述调控区中的 所述一个或多个基因变异与产量相关联，从而识别与产量提高相关的一个或多个等位基 因。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述一个或多个基因变异存在于所述多核苷酸 的编码区中。25. 根据权利要求23所述的方法，其中所述调控区是启动子元件。26. 根据权利要求23所述的方法，其中所述产量是谷物颗粒产量或种子产量。
【专利摘要】本发明公开了影响植物产量和其他农学特性的方法和组合物。还公开了提高水稻颗粒尺寸和颗粒产量的转基因调节方法和标记辅助育种方法。BG1的表达提高导致谷物颗粒尺寸增大和产量提高。
【IPC分类】C07K14/415, C12N15/113, A01H5/00, C12N15/29, C12N15/82
【公开号】CN105683213
【申请号】
【发明人】储成才, 刘林川, 童红宁, 胡斌, 梁成真, 车荣会, 徐凡
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年8月8日