改善植物农学性能的bg1组合物和方法

改善植物农学性能的bg1组合物和方法
【专利说明】
[0001 ] 交叉引用
[0002] 本实用申请要求提交于2013年8月8日的中国专利申请No. 201310343713.3的优先 权，该申请W引用方式并入本文。 陶]对^电子方式提交的序列表的引用
[0004] 2014年8月6日创建的文件名为"5648P2_sequence_listing.txt"、大小为85字节 的序列表W计算机可读的形式与本说明书同时提交，该序列表是本说明书的一部分并全文 W引用方式并入本文。
技术领域
[0005] 本公开整体设及分子生物学领域。
【背景技术】
[0006] 许多植物的驯化已与产量显著提高相关。自然群体中发生的大多数表型变异是连 续的并通过多种基因影响来实现。对造成驯化植物中产量显著不同的特定基因的鉴别已成 为农业研究的重要焦点。
[0007] 水稻是超过一半的世界人口的主要膳食组分。同时提高水稻产量和最终使用质量 仍然是一个挑战。谷物颗粒尺寸是主要育种目标，因为它既影响产量，也影响质量。运一性 状的基因控制在过去十年中得到了广泛的研究。然而，谷物颗粒尺寸的许多遗传决定子目 前只能通过定量性状基因座(Q化)进行解释，人们对编码的基因产物的性质还没有详细的 了解。本公开提供了改善谷物颗粒尺寸、形状和质量的方法和组合物。

【发明内容】

[000引本公开提供了新型基因 OsBGl的多核巧酸、相关多肤及所有保守修饰的变体，该基 因已显示出可影响水稻的谷物颗粒产量和其他农学参数。在一个实施例中，大粒基因(BG1) 同时控制谷物颗粒和节间部分的伸长。在一个实施例中，过表达BG1的转基因植物具有增大 的种子尺寸和穗长，而通过RNAi敲除BG1基因则得到较小的种子尺寸。BG1可由生长素诱导， 并且Bgl-D突变体显示出对IAA的敏感性提高且生长素极性传输增强，运改变了内源性IAA 分布。本发明公开了 BG1在水稻和其他植物的分子育种中的用途。
[0009] 改善植物农学特性的方法，该方法包括调节W下多核巧酸的表达：（i)编码包含 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1中的一者具有至少95%同一性的氨基酸序列 的多核巧酸，（ii)在严格的杂交条件下与包含SEQ ID N0:2的多核巧酸的片段杂交的多核 巧酸，其中所述片段包含SEQ ID N0:2的至少100个连续核巧酸，（iii)编码与SEQ ID N0:1 具有至少90%同一性的氨基酸序列的多核巧酸，（iv)编码多肤的多核巧酸，与SEQ ID NO: 1 相比所述多肤包含氨基酸的一个或多个缺失或插入或替换。
[0010] 在一个实施例中，通过用可操作地连接至异源启动子的重组多核巧酸转化植物来 提高编码与SEQ ID NO: 1具有至少95%同一性的多肤的多核巧酸的表达。在一个实施例中， 通过上调与内源性多核巧酸可操作地结合的调控元件的基因表达来提高编码与SEQ ID NO: 1具有至少95%同一性的多肤的内源性多核巧酸的表达。在一个实施例中，通过在SEQ ID NO: 3的调控元件的调控下表达所述多核巧酸来提高多核巧酸的表达。
[0011] 在一个实施例中，所述农学特性选自：（i)谷物颗粒尺寸增大，（i i)谷物颗粒重量 增加，（iii)穗长增大，（iv)谷物颗粒产量提高，（V)巧粒灌浆速率提高，（Vi)生物量增加。农 学特性的改善是相对于未显示BG1水平升高的对照植物(或它的变体或同系/同源物)而测 量的。在一个实施例中，农学性能为植物生物量的增加。在一个实施例中，相对于多核巧酸 的表达未提高的对照植物，谷物颗粒重量有所增加。
[0012] 在一个实施例中，植物为单子叶植物。在一个实施例中，植物为水稻或玉米。在一 个实施例中，植物为双子叶植物。在一个实施例中，植物为大豆。
[0013] 在一个实施例中，提高植物产量的方法包括提高编码多肤的多核巧酸的表达，所 述多肤包含选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:4-SEQIDN0:27的氨基酸序列或它们的等位基 因变体。
[0014] 在一个实施例中，提高水稻颗粒产量的方法包括表达编码多肤的多核巧酸，所述 多肤包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其变体。
[0015] 在一个实施例中，植物的标记辅助选择或识别与提高产量相关的先天性状的方法 包括：
[0016] a.进行植物的标记辅助选择，该植物在编码包含SEQ ID NO: 1或其变体或其调控 序列的蛋白质的基因组区域中具有一个或多个变异；W及
[0017] b.识别表现出更高产量的植物。
[0018] 在一个实施例中，在一组水稻植株中识别与谷物颗粒产量提高相关的一个或多个 等位基因的方法包括：
[0019] a.评估一组水稻植株中的下列区域中的一个或多个等位基因变异：（i)基因组区 域，该基因组区域编码多肤，或（ii)控制多肤表达的调控区，其中多肤包含SEQ ID NO: 1的 氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1具有95%同一性的序列；
[0020] b.获得该组中一个或多个水稻植株的产量提高的表型值；
[0021] C.将基因组区域中等位基因的变异与表型相关联；W及
[0022] d.识别与产量提高相关的一个或多个等位基因。
[0023] 在一个实施例中，分离的多核巧酸包括(例如）（i)编码包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27中的一者的氨基酸序列或与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27 中的一者具有至少95%同一性的氨基酸序列，（ii)在严格的杂交条件下与选自SEQ ID NO: 2的多核巧酸的片段杂交，其中所述片段包含SEQ ID N0:2的至少100个连续核巧酸，（iii) 编码与SEQ ID N0:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，（iv)编码多肤的多核巧酸，与SEQ ID NO: 1相比所述多肤包含氨基酸的一个或多个缺失或插入或替换，其中所述多核巧酸编 码参与谷物颗粒宽度、重量或产量调节的多肤。
[0024] 在一个实施例中，重组表达盒包括可操作地连接至调控元件的多核巧酸，其中该 表达盒在植物细胞中是有功能的。在一个实施例中，宿主细胞包括表达盒。在一个实施例 中，转基因植物包括重组表达盒。
[0025] 在一个实施例中，转基因植物部件包括植物调控元件，该植物调控元件可操作地 调控编码多肤的多核巧酸的表达，所述多肤包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其变体或其 同源物，其中所述调控元件与多核巧酸是异源的。
[0026] 在一个实施例中，调控表达的多核巧酸包含选自SEQ ID N0:7-SEQ ID N0:8的序 列或其功能启动子片段。
[0027] 在一个实施例中，用于提高产量的玉米植株的标记辅助选择方法包括：
[0028] a.检测多个玉米植株中的基因组区域中的或调控序列中的一个或多个基因变异， 其中所述基因组区域包含编码选自SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 14的蛋白质或其变体的多核 巧酸，所述调控序列控制其多核巧酸的表达;W及
[0029] b.将所述一个或多个变异与产量提高相关联，从而选择具有与更高产量相关的一 个或多个变异的玉米植株。
[0030] 在一个实施例中，识别一组玉米植株中的与产量提高相关的一个或多个等位基因 的方法，所述方法包括：
[0031] a.评估一组玉米植株中的下列区域中的一个或多个基因变异：（i)编码多肤的基 因组区域，或（ii)控制多肤表达的调控区，其中多肤包含选自SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 14 的氨基酸序列或与沈Q IDNO: 12-沈Q ID NO: 14具有95%同一性的序列；
[0032] b.获得该组中一个或多个玉米植株的产量数据；
[0033] C.将编码多肤的基因组区域中的或控制多肤表达的调控区中的一个或多个基因 变异与产量相关联，从而识别与产量提高相关的一个或多个等位基因。
[0034] 在一个实施例中，所述一个或多个基因变异在多核巧酸的编码区中。在一个实施 例中，调控区为启动子元件。在一个实施例中，产量为谷物颗粒产量。
[0035] 提高植物的谷物颗粒宽度、重量或产量的方法包括W下步骤:调节W下多核巧酸 的表达（i)编码包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27中的一者的氨基酸序列或与 沈Q ID N0:1、沈Q ID N0:4-沈Q ID N0:27中的一者具有至少95%同一性的氨基酸序列的 多核巧酸，（ii)在严格的杂交条件下与编码多肤的多核巧酸的片段杂交的多核巧酸，所述 多肤选自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27,其中所述片段包含编码多肤的多核巧 酸的至少100个连续核巧酸，所述多肤选自沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27(iii) 编码与SEQ ID N0:1具有至少90%同一性的氨基酸序列的多核巧酸，（iv)编码多肤的多核 巧酸，与SEQ ID NO: 1相比，所述多肤包含氨基酸的一个或多个缺失或插入或替换，其中所 述多核巧酸编码参与谷物颗粒宽度、重量或产量调节的多肤。
[0036] 在一个实施例中，包含SEQ ID NO: 2的片段的多核巧酸足W上调编码多肤的多核 巧酸的内源性表达。在一个实施例中，通过RNA干扰来实现表达的调节。
[0037] 在一个实施例中，通过诱变来实现表达的调节。在一个实施例中，通过微RNA介导 的基因沉默来实现表达的调节。在一个实施例中，通过启动子介导的基因抑制来实现表达 的调节。在一个实施例中，通过内源性调控元件的祀向诱变来实现表达的调节。
[0038] 在一个实施例中，相对于未表达多核巧酸的对照植物，谷物颗粒重量有所增加。
[0039] 在一个实施例中，表达的调节是在单子叶植物中进行的。在一个实施例中，植物为 水稻。在一个实施例中，植物为双子叶植物。
[0040] -种提高水稻颗粒的长宽比的方法包括W下步骤:调节编码多肤的多核巧酸的表 达，所述多肤包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其等位基因变体。
[0041] -种提高水稻颗粒产量的方法，该方法包括调节编码多肤的多核巧酸的表达，所 述多肤包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其变体。
[0042] -种用于提高谷物颗粒尺寸或产量的植物标记辅助选择的方法，所述方法包括W 下步骤:进行植物的标记辅助选择，其中所述植物在编码包含SEQ ID NO: 1或其变体或其调 控序列的蛋白质的基因组区域中具有一个或多个变异；W及识别产生谷物颗粒质量有所提 高和/或产量更高的谷物的植物。
[0043] -种识别水稻植株或水稻种质中与谷物颗粒质量改善和/或产量提高相关的等位 基因的方法，所述方法包括W下步骤:获得一组水稻植株，其中一个或多个植株显示谷物颗 粒质量改善和/或产量提高;相对于编码包含多肤(包含SEQ ID NO: 1)的蛋白质的多核巧酸 序列来评估等位基因变异，或在调控编码蛋白质的多核巧酸的表达的基因组区域中评估等 位基因变异;获得该组中的多个水稻植株的谷物颗粒质量改善和/或产量提高的表型值;将 与多核巧酸相关的基因组区域中的等位基因变异与所述表型相关联；W及识别与谷物颗粒 质量改善和/或产量提高相关的等位基因。
[0044] 在一个实施例中，本文所述的多核巧酸编码参与谷物颗粒宽度、重量或产量调节 的多肤。
[0045] 在一个实施例中，宿主细胞包括本文所公开的重组多核巧酸。在一个实施例中，转 基因植物包括本文所公开的重组表达盒。
[0046] 分离的多核巧酸可操作地调控编码多肤的多核巧酸的表达，所述多肤包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其变体。在一个实施例中，调控表达的多核巧酸包含SEQ ID N0:3的序 列或其功能启动子片段。
[0047] 表1序列说明
[0048] 本申请随附的且W引用方式并入本文的序列说明和序列表符合美国联邦法规 37C. F. R. §1.821-1.825中关于专利申请中的核巧酸和/或氨基酸序列公开的指导规则。
[0049] 序列表包含核巧酸序列特征的单字母代码和氨基酸的Ξ字母代码，其符合 Nucleic Acids Res. 13:3021-3030( 1985)(《核酸研究》，第 13卷，第3021-3030页，1985年） 和Biochemical J. 219(2) :345-373( 1984)(《生物化学杂志》，第219卷，第2期，第345-373 页，1984年）中所描述的IUPAC-IUBMB标准，所述文献W引用方式并入本文。用于核巧酸和氨 基酸序列数据的符号和格式符合37C .F.R.§1.822中所示的规则。
[(Κ)加 ]
[0化1 ]
[0化2]
[0053] 在另一个方面，本公开设及包含所述核酸的重组表达盒。另外，本公开设及包含该 重组表达盒的载体。此外，包含该重组表达盒的载体可有利于该核酸在宿主细胞中的转录 和翻译。本公开还设及能够表达本公开的多核巧酸的宿主细胞。可W使用多种宿主细胞，诸 如但不限于微生物、哺乳动物、植物或昆虫细胞。
[0054] 在另一个实施例中，本公开设及含有本公开的核酸的转基因植物或植物细胞。含 有本公开的多核巧酸的优选植物包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、首 猜、棉花、水稻、大麦、西红柿和稷。在另一个实施例中，转基因植物为玉米植物或植物细胞。 另一个实施例是来自本公开的转基因硝酸盐摄取相关多肤的转基因种子，该多肤可操作地 连接至在植物中驱动表达的启动子。与对照植物相比，本公开的植物可具有改善的谷物颗 粒质量。
【附图说明】
[0055] 图1示出了 Bgl-D突变体的表型。（A).在1/2MS培养基上生长的10天龄幼苗。比例 尺，5畑1。（8和C).在稻田中生长的2月龄(B)或4月龄(C)植株的生长表型。比例尺，10cm。（D和 E).相较于Bgl-D，幼穗化)和收获的穗化)显示长度增大。比例尺，5畑1。巧）.相对于Bgl-D，成 熟种子显示尺寸增大。比例尺，10mm。
[0056] 图2示出了抽穗前颖壳的组织学分析。（A).野生型或Bgl-D植物的小穗。比例尺， 2mmD(B).颖壳的横截面。虚线指示横截面的位置。比例尺，0.5mmD(C).B中框出的横截面的 放大视图。比例尺，0.1mm。（D-F).由野生型和Bgl-D植物形成的颖壳的外实质层的总面积 (D)、细胞数化）和细胞面积(F)。所有数据均为平均值±S.D.(n=15)。用学生t检验生成P 值。* 冲 <0.01。
[0057] 图3示出了 BG1基因的鉴定。（A).Bgl-D突变体的T-DNA侧翼区的示意图。称为BG1的 负责表型(0s03g0175800,其编码具有未知功能的新型蛋白质，蓝色）的候选0RF位于T-DNA 插入序列的下游0.8-化。水稻Actinl启动子用绿色箭头示出，LB和RB为T-DNA的左右边界。 (B).野生型和Bgl-D植物中的BGlmRNA的表达水平。数据得自Ξ次独立的平行测定。值W平 均值±S.D.表示。
[005引图4示出了 BG1的系统发育分析。根据绿色植物中的BGl(0s03g0175800)同源物的 氨基酸序列推断出MEGA4邻接树。自展值基于1000个平行测定并在它们各自的节点中显示。 比例尺指示基于分支长度的遗传距离。沈Q ID NO:l、沈Q ID N0:4-SEQ ID NO:27代表BG1 的系统发育中所示的序列。
[0059] 图5示出了 BG1的表达模式。（A).通过定量RT-PCR分析得到的各个器官中BG1的表 达。在2月龄野生型(Nipponpare)植株中收获的根、茎、叶和叶銷。使用不同长度的幼穗(YP) 进行分析，数字表示长度(厘米）。数据得自Ξ次独立的平行测定。(B).PR0BG1:GUS转基因株 系组织的GUS染色。（a)幼茎横截面的显微镜观察。（b)幼穗。（C)发育中的外壳。（d)外壳的横 截面。（e)成熟的谷物颗粒。
[0060] 图6示出了过表达BG1的转基因水稻植株中增大的谷物颗粒尺寸和增加的重量。 (A).野生型(WT)、0E-l、0E-2和0E-3转基因植物的总体形态。比例尺，20畑1。（8).示出了野生 型和转基因植物的穗长对比。比例尺，5cm"(C).示出了野生型和转基因植物的谷物颗粒形 态。比例尺，5mm。(D)野生型和转基因植物中BG ImRNA的相对表达水平。数据得自Ξ次独立的 平行测定。化-F).示出了野生型和转基因植物的谷物颗粒长度化）、谷物颗粒宽度(F)和每 1000粒重量(G)的对比。^斗）.06-1、(^-2、(^-3表示661过表达的^种代表性转基因株系。 化-G)值W平均值±S.D.表示化和F中n = 20，G中n = 5)。*冲<0.01(t检验）。
[0061] 图7示出了表型BGl-RNAi植物(Ri)D(A和B).示出了野生型(WT)和BGl-RNAi植物的 整体形态。60天龄(A)，比例尺，10畑1。100天龄(B).比例尺，10畑1。（C)野生型和BGl-RNAi植物 的穗长对比。比例尺，5cm。（D).示出了野生型和BGl-RNAi植物的谷物颗粒形态。比例尺， 5mm。化)野生型和BG1 -RNAi植物中BGImRNA的相对表达水平。数据得自Ξ次独立的平行测 定。（F).野生型和BGl-RNAi植物的每1000粒重量的对比。值W平均值±S.D.表示。（n = 5)。* P<0.05，*冲<0.01 (t检验）。(A-F). Ri-1、Ri-2表示BGl-RNAi植物的两个代表性转基因株系。
[0062] 图8表明BG1主要集中于质膜。（A).水稻根部的共聚焦显微照片示出了祀向BG1的 质膜。示出了使用pCambia 35S: :eGFP(上方面板)和pCambia 35S: :BGl-eGFP(下方面板)质 粒转化的水稻。比例尺，50yM"DIC指示微分干设对比度，eGFP指示蛋白质的增强的绿色巧 光，合并指示eGFP和DIC的合并。（B).幼苗蛋白质提取物中的BG1的免疫印迹分析。(a).分离 7天龄幼苗中的微粒体(P)和可溶(S)片段。（b).双相膜分离的片段，质膜(P)和其他膜(0)。 使用阳PC(憐酸締醇式丙酬酸簇化酶)作为细胞溶质对照物，使用LHCII和水通道蛋白PIP2; 1作为其他膜和质膜对照物。
[0063] 图9显示BG1为生长素应答基因。不同植物激素处理下BG1的相对表达水平。（B)响 应于1 ΟμΜ IAA处理，BG1随时间的变化。（C)放线菌酬导致BG1的表达水平提高。（D)BG1针对 不同生长素化合物的响应。（A-D)数据得自Ξ次独立的平行测定。误差线代表平均值±SD(n = 3KE)BG1基因促进正在伸长的叶銷中的生长素诱导的生长。
[0064] 图10显示Bgl-D具有增强的极性生长素传输(PAT)。
[0065] 野生型、Bgl-D和BGl-RNAi (化2)植物在黑暗中生长的胚芽銷中PAT的对比。误差线 代表平均值±SD(n = 5)。星号表示由学生t检验确定的差异的意义:**0.001<P<0.01。
[0066] 图11示出了WT和Bgl-D中参与细胞周期和细胞扩张的基因的表达水平。（A)Bgl-D 中参与细胞周期G1期至S期的基因有所上调。（B)Bgl-D中参与细胞扩张的扩张蛋白基因有 所上调。误差线代表平均值±SD(n = 3)。
[0067]图12示出了由其天然启动子过表达BG1的转基因水稻植物中提高的谷物颗粒产 量。（A).野生型(WT)、0E-5和0E-7转基因植物的总体形态。比例尺，20畑1。（8).野生型和转基 因植物的谷物颗粒形态。比例尺，5皿。（〇.野生型和转基因植物中收获的每棵植株的总穗 数对比。比例尺，5cm"(D和E).野生型和转基因植物的每1000粒重量(D)和每棵植株的产量 化)对比。（A-E).0E-5、0E-7表示由BG1天然启动子驱动的BG1过表达的两个代表性转基因株 系。（D-E)值W平均值±S.D.表示(D中n=10，G中n = 25)〇*0.01 <P<0.05，**0.001 <P<0.01 (学生t检验）。
[006引图13示出了Bgl-D幼苗的加速生长。（A)野生型和Bgl-D植株的7天龄幼苗。比例尺， 2cm。（B)种子发芽后一周内野生型和Bgl-D植株的植株高度对比。（C)野生型和Bgl-D植株的 7天龄幼苗的叶銷长度对比。数据W平均值±S.E.表示(n = 20)。
[00例图14示出了Bgl-D颖壳中细胞长度增大。(A)颖壳的纵剖面的近距离视图。比例尺， 50皿。（B)野生型和Bgl-D植株中内釋和外釋细胞层的细胞长度对比。数据W平均值±SE表 示(n = 15)。用学生t检验生成P值。**0.001 <P<0.01。
[0070] 图15表明Bgl-D具有提高的巧粒灌浆速率。（A)WT和Bgl-D受精后胚乳鲜重对比。 (B)WT和Bgl-D受精后胚乳干重对比。数据W平均值±SE表示(n = 40)。
[0071] 图16示出了水稻和拟南芥属中BG1的系统发育和氨基酸序列分析。（A)BGl的系统 发育关系。（8化61的序列比对（569 10顯:4、沈〇10顯:5、56〇10^:7、569 10^:10或 SEQ ID NO: 1，和该顺序的SEQ ID NO: 11)。保守氨基酸W黑色和灰色色调高亮显示:具有黑 色背景的白色字母(100%同一性），具有灰色背景的白色字母(80%同一性），具有灰色背景 的黑色字母(60%同一性）。另外参见本文所公开的总体同一性(表2)和总体相似性(表3)。
[0072] 图17表明OsBGl的过表达导致拟南芥属的器官尺寸增大。(A)过表达OsBGl的5天龄 幼苗的伸长的下胚轴(B-D)OsBGl促进叶尺寸(B)、茎长(C)和种子尺寸(D)的增大。3#和50# 表示由35S启动子驱动的拟南芥属中OsBGl过表达的两个代表性转基因株系。
[0073] 图18显示BG1的激活导致极性生长素传输(PAT)提高(A)用Ο.ΙμΜ NAA处理的7天龄 幼苗的表型。（B)WT和Bgl-D植株的根长度对比。数据W平均值±SE表示(η = 20)。用学生t检 验生成P值。**〇. 001 < P<〇. 01。
[0074] 图19表明BG1的激活导致生物量增加。用成熟器官的干重计算生物量。0E-U0E-2 和0E-3表示Ξ个独立的转基因株系。Ri-1和Ri-2表示BGl