-RNAi的两个代表性转基因植株。 误差线代表平均值±SD(n = 20)。
【具体实施方式】
[0075] 谷物颗粒尺寸是（例如水稻)颗粒产量的一个重要因素，其一直在接受选择，因为 谷物是首选被驯化的。
[0076] -种生产种子的方法，所述方法包括：（a)将第一植物与第二植物进行杂交，其中 第一植物和第二植物中的至少一者包含重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含可操 作地连接至至少一个异源调控元件的多核巧酸，其中所述多核巧酸编码多肤，所述多肤具 有与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27具有至少70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的氨基酸序列(基 于Clus化1 V或Clus化1 W比对方法，使用各自的默认参数）；W及(b)选择步骤(a)的杂交的 种子，其中所述种子包含重组DNA构建体。当与不包含重组DNA构建体的对照植株进行比较 时，由所述种子生长出的植株可表现出至少一种选自W下的性状:提高的氮胁迫耐受性、提 高的产量、增加的生物量和改变的根构造。多肤可在所述植物的至少一种组织中过表达，或 者在至少一种非生物胁迫条件下过表达，或两者兼具。所述植物可选自：玉米、大豆、向日 葵、高梁、卡诺拉、小麦、首猜、棉花、水稻、大麦、小米、甘薦和柳枝稷。
[0077] -种生产植物的方法，该植物在至少一种选自W下的性状上表现出提高：提高的 氮胁迫耐受性、提高的产量、增加的生物量和改变的根构造，其中所述方法包括用包含重组 DNA建构体的种子种植植物，其中所述重组DNA建构体包含可操作地连接至至少一个异源调 控元件的多核巧酸，其中所述多核巧酸编码多肤，所述多肤具有与SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:4-SEQ ID N0:27具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列（基于(：11131日1￥或(：1113化1￥比对 方法，使用各自的默认参数），其中当与不包含重组DNA建构体的对照植物进行比较时，所述 植物表现出至少一种选自W下的性状：：提高的氮胁迫耐受性、提高的产量、增加的生物量 和改变的根构造。所述多肤可在所述植物的至少一种组织中过表达，或者在至少一种非生 物胁迫条件下过表达，或两者兼具。所述植物可选自：玉米、大豆、向日葵、高梁、卡诺拉、小 麦、首猜、棉花、水稻、大麦、小米、甘薦和柳枝稷。
[0078] 除非另外指明，否则本公开的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物 学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，运些技术处于本领域技能范围内。运类技术 在文献中有完整的解释。参见例如，Langenheim and Thimann,(1982)Botany:Plant Biology and Its Relation to Human Affairs John Wiley(Langenheim和Thimann，1982 年，《植物学：植物生物学及其与人类事务的关系》，约翰威立出版社）；Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,vol.l,"Vasil,ed. (1984)(《细胞培养和植物体细胞遗 传学》，第 1 卷，Vasil编辑，1984年）；Stanier，et al.，（1986)The Microbial World,5th ed. ,Prentice-化11(Stanier等人，1986年，《微生物界》，第5版，Prentice-化11出版社）； Dhringra and Sinclair,(1985)Basic Plant Pathology Methods,CRC Press(Dhringra 和Sinclair,1985年，《基本植物病理学方法》，CRC出版社）；Maniatis，et al. ,(1982) Molecular Cloning:A LaboratoiT Manual(Maniatis等人，1982年，《分子克隆实验指 南》）；DNA Cloning，vols.I and 11，61〇￥6'，6(1.(1985)(《0論克隆》，第1卷和第11卷， Glover编辑，1985年）；Oligonucleotide Synthesis,Gait ,ed. (1984)(《寡核巧酸合成》， Gait编辑，1984年）；Nucleic Acid Hybridization,化mes and Higgins,eds. (1984)(《核 酸杂交》，化mes和Higgins编辑，1984年）和丛书Methods in Enzymology,Colowick and Kaplan,eds,Academic Press,Inc. ,San Diego,CA(《酶学方法》，Colowick和Kaplan编辑， 学术出版社，加州圣地亚哥）。
[0079] 所谓"扩增"意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构 建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行的。扩增系统包括聚合酶链式反应 (PCR)系统、连接酶链式反应化CR)系统、基于核酸序列的扩增(安大略省米西索加市加拿大 基因公司（Cangene,Mississauga,Ontario))、Q-0复制酶系统、基于转录的扩增系统（TAS) 和链置换扩增（SDA)。参见例如Diagnostic Molecular Microbiology:P;rinciples and Applications,Persing,et al. ,eds. .American Society for Microbiology , Washington，DC( 1993)(《诊断分子和微生物学：原理和应用》，Arsing等人编辑，美国微生 物学会，华盛顿，1993年）。扩增的产物称为扩增子。
[0080] 应当理解，本领域的技术人员将会知道，本公开不仅仅涵盖特定的示例性序列。在 给定位点产生化学等同的氨基酸，但不影响编码多肤的功能特性的核酸片段的变化是本领 域熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一个疏水性较小的残基诸如甘氨 酸，或疏水性较大的残基诸如鄉氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子替换。类似地，还可预期 使一个带负电的残基替换为另一个，诸如天冬氨酸替换为谷氨酸，或一个带正电的残基替 换为另一个，诸如赖氨酸替换为精氨酸的变化产生功能等同的产物。还可预期使多肤分子 的N-端和C-端部分改变的核巧酸变化不会改变多肤的活性。每个所推荐的改变均在本领域 的常规技术内，正如确定编码产物的生物活性的保留。
[0081] 本文所公开的蛋白质也可W是包含一种氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列包 含选自SEQ ID N0:1或其变体的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、替换、插入和/ 或添加。替换可W是保守的，意指某氨基酸残基被另一个具有类似物理和化学特性的残基 取代。保守替换的非限制性例子包括含脂族基团的氨基酸残基诸如lie、化l、Leu或Ala之间 的取代，W及极性残基之间的取代，诸如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn取代。
[0082] 来源于氨基酸缺失、替换、插入和/或添加的蛋白质可在编码其野生型蛋白质的 DNA受到例如已知的定点诱变时制备（参见例如Nucleic Acid Research ,Vol. 10 ,No . 20, p.6487-6500,1982(《核酸研究》，第10卷，第20期，第6487-6500页，1982年），该文献全文据 此W引用方式并入）。如本文所用，术语"一个或多个氨基酸"旨在意指可通过定点诱变而缺 失、替换、插入和/或添加的氨基酸的可能数量。
[0083] 定点诱变可W例如如下使用与待突变的单链隧菌体DNA互补，不同的是具有特定 错配(即，所需突变)的合成寡核巧酸引物来实现。也就是说，上述合成寡核巧酸用作引起互 补链通过隧菌体合成的引物，然后所得的双链DNA用于转化宿主细胞。将转化细菌培养物置 于琼脂上，从而允许隧菌斑从含隧菌体的单个细胞形成。因此，理论上，50%的新菌落包含 突变为单链的隧菌体，而其余50%具有原始序列。在允许与DNA杂交(该DNA与具有上述所需 突变的DNA完全相同），但不与具有原始链的DNA杂交的溫度下，允许所得的隧菌斑与通过激 酶处理标记的合成探针杂交。随后，拾取与探针杂交的隧菌斑并培养W收集其DNA。
[0084] 允许生物活性肤(诸如酶）的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、替换、插 入和/或添加，同时保持其活性的技术包括上述定点诱变，W及其他技术，诸如用诱变剂处 理基因的那些，W及其中基因选择性裂解W移除、替换、插入或添加所选的一个或多个核巧 酸然后连接的那些。
[0085] 本文所公开的蛋白质也可W是由包含运样的核巧酸序列的核酸编码的蛋白质，所 述核巧酸序列包含选自编码56〇10顯：1、56〇10^:4-569 10^:27的序列的核巧酸序 列中的一个或多个核巧酸的缺失、替换、插入和/或添加。核巧酸缺失、替换、插入和/或添加 可通过定点诱变或上述其他技术来实现。
[0086] 本文所公开的蛋白质也可W是由包含运样的核巧酸序列的核酸编码的蛋白质，所 述核巧酸序列能够在严格条件下与选自编码SEQIDN0:1、SEQIDN0:4-SEQIDN0:27的 序列的核巧酸序列的互补链杂交。
[0087] 术语"在严格条件下"意指两个序列在中等或高度严格条件下杂交。更具体地讲， 本领域的普通技术人员可W例如根据DNA的长度容易地确定中等严格条件。W下文献列出 了分子克隆的基本条件：Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, third edition , chapters 6曰nd 7, Cold Spring Harbor Laboratory Press ,2001 (Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第Ξ版，第6章和第7章，冷泉港实验室出版社，2001 年），并且包括使用硝化纤维过滤器的预洗涂溶液5 X SSC、0.5%SDS、1. OmM邸TA(pH 8.0)， 约50%甲酯胺、2 X SSC至6 X SSC、约40-50°C的杂交条件(或其他类似杂交溶液，诸如Stark 溶液，约50%甲酯胺、约42°C) W及例如约40-60°C、0.5-6 X SSC、0.1 %SDS的洗涂条件。优选 地，中等严格条件包括在约50°C和6 X SSC下杂交(和洗涂）。本领域的技术人员也可W例如 根据DNA的长度容易地确定高度严格条件。
[0088] -般来讲，此类条件包括与中等严格条件相比，在较高溫度和/或较低盐浓度下杂 交和/或洗涂(诸如在约65°C，6 X SSC至0.2 X SSC，优选地6 X SSC，更优选地2 X SSC，最优选 地0.2 XSSC下杂交）。例如，高度严格条件可包括如上所定义的杂交，并且在大约65-68°C、 0.2 X SSC、0.1 % SDS下洗涂。在杂交和洗涂缓冲液中SSPE( 1 X SSPE为0.15M化Cl、lOmM 化H2P04和1.25mM邸TA，pH7.4)可代替SSCαxSSC为0.15M化α和15mM巧樣酸钢）；杂交 完成后进行15分钟的洗涂。
[0089] 使用商购获得的杂交试剂盒也是可能的，其不使用放射性物质作为探针。具体例 子包括用E化直接标记和检测系统进行杂交。严格条件包括例如使用包含在试剂盒中的杂 交缓冲液在42°C下杂交4小时，该缓冲液补充有5%(w/v)阻断试剂和0.5M NaCl，并且在 0.4% SDS、0.5 X SSC中55°C下洗涂20分钟两次，在2 X SSC中室溫下洗涂5分钟一次。
[0090] 就指定的核酸而言，所谓"编码"或"编码的"意指包含翻译成指定蛋白质的信息。 编码蛋白质的核酸可在该核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子），或可缺少运种居 间的非翻译序列(例如，如在cDNA中）。据W编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。 通常，氨基酸序列由核酸利用"通用"遗传密码来编码。然而，当利用运些生物体表达核酸 时，可使用诸如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体（My cop lasma capricolum) "amao , et al. , (1985)P;roc .化tl .Acad. Sci .USA 82 : 2306-9(Yamao等人， 1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309页））或纤毛虫大核（ciliate Macronucleus)中存在的通用密码的变体。
[0091] 当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密 码子偏好性。例如，尽管本公开的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表 达，但可对序列进行修饰W解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏 好性，因为运些偏好性已被证实不同（Murray,et al.,(1989)Nucleic Acids Res. 17:477- 98(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页），该文献W引用方式并入本 文）。因而，用于特定氨基酸的玉米优选密码子可来源于来自玉米的已知基因序列。关于来 自玉米植物的28种基因的玉米密码子的用法在Murray等人（出处同上）的表4中列出。
[0092] 如本文所用，针对核酸的"异源"为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同 物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了 实质性修饰的核酸。异源的还可W表示相比于在基因组中的天然位置，特定核酸对于其在 基因组中的位置而言是外来的。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子来自一个物 种，该物种不同于拥有该结构基因的物种，或者如果来自相同的物种，则对一者或二者由其 原始形式进行了实质性修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种， 则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质性的修饰。
[0093] 所谓"宿主细胞"意指包含本公开的异源核酸序列、含有载体并支持该表达载体的 复制和/或表达的细胞。宿主细胞可W是原核细胞诸如大肠杆菌化.coli)，或真核细胞诸如 酵母，昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶 植物细胞，包括但不限于玉米、高梁、向日葵、大豆、小麦、首猜、水稻、棉花、卡诺拉、大麦、小 米和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。
[0094] 术语"杂交复合物"包括设及由相互选择性杂交的两条单链核酸序列形成的双链 核酸结构。
[0095] 在将核酸插入细胞中的语境中，术语"引入"意指"转染"或"转化"或"转导"，并包 括设及将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组（例如染色体、质 粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
[0096] 术语"分离的"指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其 天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未 发现在其天然环境中与其一起的物质。本文所定义的"分离的"核酸也称为"异源"核酸。除 非另有规定，否则术语"硝酸盐吸收相关的核酸"意指包含编码全长或部分长度硝酸盐吸收 相关的多肤的多核巧酸Γ硝酸盐吸收相关的多核巧酸"）的核酸。
[0097] 如本文所用，"核酸"包括指单链或双链形式的脱氧核糖核巧酸或核糖核巧酸聚合 物，并且除非另外限制，否则涵盖在W下方面具有天然核巧酸的基本性质的已知类似物:其 W与天然存在的核巧酸(例如肤核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
[0098] 所谓"核酸文库"意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且基本上代表指定生物 体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库（诸如基因组文库和cDNA文库）的构 建，在诸如W下的标准分子生物学参考文献中有教导：Berger and Kimmel,(1987)Guide To Molecular Cloning Techniques, from the series Methods in Enzymology, vol. 152 ,Academic Press, Inc. , San Diego ,CA(Berge;r和Kimmel，1987年，《分子克隆技术 指南》，来自《酶学方法》系列，第152卷，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥）；Sambrook，et al. , (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2"*^ ed. ,vols. l-3(Sambrook 等人， 1989年，《分子克隆实验指南》，第2版，第1-3卷）；W及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,et al.,eds.Current Protocols ,a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.and John Wiley&Sons , Inc. (1994Supplement)(《现代分子 生物学实验技术》，Ausubel等人编辑，《现代实验技术》，格林出版社联合公司W及约翰威立 父子公司的合资公司，1994年增补本）。
[0099] 本文所用的"可操作地连接"包括指第一序列（诸如启动子)和第二序列之间的功 能连接，其中该启动子序列引发和介导对应于该第二序列的DNA的转录。一般来讲，可操作 地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是 连续的且在相同的阅读框内。
[0100] 本文所用的术语"植物"包括指整个植株、植物器官（例如叶、茎、根等）、种子和植 物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织 区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、抱子体、花粉和小抱子。可用于本公开方法中的植物的类 别通常与适于转化技术的高等植物的类别一样宽，包括单子叶植物或双子叶植物两者在 内，包括W下各属的物种在内：南瓜属(化curbita)、菩薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属 (Juglans)、草替属（Fragaria)、百脉根属化otus)、首猜属（Medicago)、驴食草属 (OnobiTchis)、Ξ叶草属（Trifolium)、胡卢己属（Trigone 11a)、班豆屬（Vigna)、相橘属 (Citrus)、亚麻属(Xinum)、老鹤草属（Geranium)、木馨属(Manihot)、胡萝h属（Daucus)、鼠 耳芥屬（Arabidopsis)、芸苔属（Brassica)、萝h属（Raphanus)、白芥属（Sinapis)、颠茄属 (Atropa)、辣椒属（Capsicum)、曼巧罗属（Datura)、天仙子属（Hyoscyamus)、番茄属 化7。〇9日'3；[。0]1)、烟草属（化。〇1:1日]1日）、茄属（5〇1日]111111)、矮牵牛属。日1：11]11日）、毛地黄属 (Digitalis)、Majorana、菊宦屬（Ciahorium)、向日葵属巧elianthus)、窝宦属(Xactuca)、 雀麦属（Bromus)、天口冬属（Asparagus)、金鱼草属（Antirrhinum)、宣草屬 (Heterocallis)、化mesis、天竺葵屬（Pelargonium) Janieum、狼尾草属（Pennisetum)、毛 良属（Ranunculus)、千里光属（Senecio)、蛾蝶花屬（Salpiglossis)、黄瓜属（Cucumis)、 Rrowaalia、大豆属(Glycine)、魏豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Xolium)、稻 属（OiTza)、燕麦属（Avena)、大麦属化ordeum)、黑麦属（Secale)、葱属(Allium)和小麦属 (Triticum)。特别优选的植物是玉米(Zea mays)。
[0101] 本文所用的"多核巧酸"包括指具有天然核巧酸的必要性质的脱氧核糖多核巧酸、 核糖多核巧酸或其类似物，它们具有该必要性质是因为它们能在严格杂交条件下杂交至与 天然存在的核巧酸所杂交的核巧酸基本上相同的核巧酸序列，和/或容许翻译成与天然存 在的核巧酸所翻译成的氨基酸相同的氨基酸。多核巧酸可W是天然或异源结构基因或调控 基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括设及指定的序列及其互补序 列。因而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所 意指的"多核巧酸"。此外，包含稀有碱基(诸如次黄嚷岭核巧)或修饰碱基(诸如Ξ苯甲基化 的碱基）（仅举两个例子)的DNA或RNA是多核巧酸(如该术语在本文所用的）。应当理解，已对 DNA和RNA进行了很多种修饰，运些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所 用的术语多核巧酸涵盖多核巧酸的运类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，W及病毒 和细胞(包括特别是简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。
[0102] 术语"多肤"、"肤"和"蛋白质"在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。运些 术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的 氨基酸聚合物，W及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0103] 本文所用的"启动子"包括指DNA的在转录起始的上游并设及RNA聚合酶和其他蛋 白质的识别和结合W启动转录的区域。"植物启动子"是能够在植物细胞中启动转录的启动 子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因 的细菌获得的那些启动子，所述细菌诸如农杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(lihizobium)。 例如，在某些组织诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中优先启动转录的 启动子。运种启动子称为"组织优选的"。"细胞类型"特异性启动子主要驱动在一种或多种 器官中的某些细胞类型（例如，根或叶中的维管细胞）中的表达。"诱导型"或"调控型"启动 子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的例子包 括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调控的启动子，例如在花粉发育过程中 驱动表达的启动子。组织偏好启动子、细胞类型特异性启动子、发育调控的启动子和诱导型 启动子构成"非组成型"启动子类别。"组成型"启动子是在大多数环境条件下活跃的启动 子。合适的组成型启动子包括(例如)泛素启动子、肌动蛋白启动子和G0S2启动子(Pater et al (1992)，The Plant Journal，2:837-844(Pater等人，1992年，《植物学报》，第2卷，第837- 844页)）。
[0104] 本文所用的"重组