改善植物农学性能的bg1组合物和方法_3

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的"包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体,或者源 于经运样修饰过的细胞的细胞。因此,例如,重组细胞可由于蓄意人为干预而表达不W同样 形式存在于天然(非重组)形式的该细胞内的基因或者表达原本被异常表达、低表达或根本 不被表达的天然基因;或者可具有减低了的或消除了的天然基因表达。本文所用的术语"重 组的"不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载 体的改变,所述事件诸如在没有有意人为干预的情况下发生的那些。
[0105] 本文所用的"重组表达盒"是核酸构建体,通过重组法或合成法产生,具有一系列 规定的核酸元件,其允许特定核酸在祀细胞中的转录。重组表达盒可渗入质粒、染色体、线 粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常,除了其他序列W外,表达载体的重组表达盒部 分还包含待转录的核酸和启动子。
[0106] 如本文所用,"转基因植物"包括指在其基因组内包含异源多核巧酸的植物。一般 来讲,异源多核巧酸稳定地整合在基因组内使得该多核巧酸得W传递到连续世代。异源多 核巧酸可单独整合进基因组中,或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。"转基因" 在本文中用来包括其基因型已因异源核酸的存在而被改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、 组织、植物部分或植物,包括那些最初如此改变的转基因 W及那些通过从最初的转基因进 行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。如本文所用,术语"转基因"不涵盖通过常规 植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或 自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。
[0107] 本文所用的"载体"包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核巧酸的核酸。载 体常常是复制子。表达载体容许插入其中的核酸的转录。
[0108] W下术语用来描述两条或更多条核酸或多核巧酸或多肤之间的序列关系:(a)"参 考序列",(b)"比较窗口",(C)"序列同一性",(d)"序列同一性百分比"和(e)"基本上同一 伴'。
[0109] 如本文所用,"参考序列"是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可W是指 定序列的子集或全体;例如,作为全长cDNA或基因序列的区段,或者完全的cDNA或基因序 列。
[0110] 本文所用的"比较窗口"意指包括指多核巧酸序列的连续和指定的区段,其中该多 核巧酸序列可与参考序列进行比较,并且其中所述多核巧酸序列在比较窗口中的部分相比 于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位),W便两个序列的最佳比对。 通常,比较窗口长度为至少20个连续的核巧酸,任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技 术人员理解,为避免由于在多核巧酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性,通 常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
[0111] 将核巧酸和氨基酸序列进行比对W作比较的方法是本领域公知的。Smith and Waterman, (1981 )Adv. Appl .Math 2:482(Smith和Waterman,1981年,《应用数学进展》,第2 卷,第482页)的局部同源算法(BESTFIT)可对用于比较的序列进行最佳比对;Needleman and Wunsch,( 1970) J.Mol.Biol. 48:443-53(化edleman和Wunsch,1970年,分子生物学杂 志,第 48 卷,第 443-453 页)的同源比对算法(GAP);Pearson and Lipman,( 1988) Proc. Natl. Acad. Sci . USA 85:2444(Pearson和Lipman,1988年,《美国国家科学院院刊》,第 85卷,第2444页)的相似性捜索算法(Tfasta和化sta);运些算法的计算机化执行包括但不 限于:加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics .Mountain View, California)的PC/Gene程序中的CLUSTAL、WisconsinGenetics软件包,第8版(可得自 Genetics Computer G;toup(GCGK程序,加利福尼亚州圣地亚哥Accelrys公司 (Accel巧S,Inc.,San Diego,CA))中的GAP、邸STFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。化USTAL程序 在W下文献中得到很好的描述:Higgins and Sha;rp,(1988)Gene 73:237-44化iggins和 化日巧,1988年,《基因》,第73卷,第237页);化旨旨1118日11(1化日巧,(1989化481055:151-3 化iggins和化曰巧,1989年,《计算机在生物科学中的应用》,第5卷,第151-153页);Co巧et, et al.,(1988)Nucleic Acids Res.l6:10881-90(C〇巧et等人,1988年,《核酸研究》,第 16 卷,第10881-10890页);Huang,et al.,(1992)Computer Applications in the Biosciences 8:155-65化uang等人,1992年,《计算机在生物科学中的应用》,第8卷,第155- 165页)W及化arson,et al .,( 1994)Meth .Mol. Biol. 24:307-31 (Pearson等人,1994年,《分 子生物学方法》,第24卷,第307-331页)。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是 PileUp(Feng and Doolittle,(1987)J.Mol.Evol.,25:351-60Weng和Doolittle,1987年, 《分子进化学杂志》,第25卷,第351-360页),其类似于Higgins and化日巧,(1989)CABI0S5: 151-53化iggins和化曰巧,1989年,《计算机在生物科学中的应用》,第5卷,第151-153页)中 描述的方法,将文献W引用方式并入本文。可用于数据库相似性捜索的化AST程序家族包 括:用于核巧酸查询序列对核巧酸数据库序列的BLASTN;用于核巧酸查询序列对蛋白质数 据库序列的BLASTX;用于蛋白质查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTP;用于蛋白质查询 序列对核巧酸数据库序列的TBLASTN和用于核巧酸查询序列对核巧酸数据库序列的 TBLASTX。参见Current Protocols in Molecular Biology .Chapter 19 ,Ausubel et al., eds.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,化w 化rk(1995)(《现代分子生物学 实验技术》,第19章,Ausubel等人(编辑),威利-英特科学出版公司,纽约,1995年)。
[0112] 如本领域普通技术人员将会理解的,BLAST捜索假定蛋白质可W随机序列建模。然 而,许多真实蛋白质包含非随机序列区,该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种 或多种氨基酸的区域。运种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对,尽管该蛋白质的 其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少运种低复杂性比对。例如,可单 独使用或组合使用SEG(Wooten and 化derhen,( 1993),Comput.Chem. 17:149-63(Wooten和 Federhen,1993年,《计算化学杂志》,第17卷,第149-163页))和XNlKClaverie and Sl:ates, (1993)Comput. Chem. 17:191-201 (Claverie 和 S化 tes,1993年,《计算化学杂志》,第 17卷,第 191-201页))低复杂性过滤程序。
[0113] 在两条核酸或多肤序列的情形中,本文所用的"序列同一性"或"同一性"包括是指 当在指定的比较窗口上进行比对W获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性 百分比针对蛋白质使用时,认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸替换,其中 氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基替换,因此不会改 变分子的功能性质。如果序列差别在于保守替换,则可上调序列同一性百分比w校正替换 的保守性质。差异在于运种保守替换的序列被称为具有"序列相似性"或"相似性"。作出运 个调整的手段是本领域技术人员公知的。通常,运设及将保守替换评定为部分错配而不是 完全错配,从而提高了序列同一性百分比。因此,例如,如果相同的氨基酸给予1分,非保守 替换给予0分,则保守替换给予0至1之间的分数。例如,根据Meyers and Miller,(1988) Computer Applic.Biol.Sci .4:11-17(Meyers和Miller,1988年,《计算机在生物科学中的 应用》,第4卷,第11-17页)的算法计算保守替换的分数,例如如在程序PC/GE肥(美国加利福 尼亚少Η山景城Intelli邑enetics公司(Intelli邑enetics .Mountain View,California, USA))中所实现的。
[0114] 本文所用的"序列同一性百分比"意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序 列所确定的数值,其中多核巧酸序列在该比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺 失)相比可包含添加或缺失(即,空位),W便两个序列的最佳比对。该百分比是运样计算的: 确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目W得到匹配的位置的数 目,将匹配的位置的数目除W比较窗口中的位置的总数目,然后将结果乘W100W得到序列 同一性百分比。
[0115] 术语多核巧酸序列的"基本上同一性"意指利用所描述的比对程序之一采用标准 参数与参考序列比较时,多核巧酸包含具有50-100%之间的序列同一性,优选至少50%的 序列同一性,优选至少60 %的序列同一性,优选至少70 %,更优选至少80 %,更优选至少 90%且最优选至少95%序列同一性的序列。技术人员将会认识到,可通过考虑密码子简并 性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整运些值W确定两个核巧酸序列所编码的蛋白 质的相应同一性。出于运些目的,氨基酸序列的基本上同一性通常意指55-100%之间,优选 至少55%,优选至少60%,更优选至少70%、80%、90%,最优选至少95%的序列同一性。
[0116] 直系同源和旁系同源
[0117] 上述同源序列可包含直系同源序列和旁系同源序列。本领域技术人员已知有若干 不同方法用于鉴别和定义运些功能上同源的序列。描述了用于定义直系同源物和旁系同源 物的Ξ种一般方法;可通过下述方法中的一种或多种来鉴别直系同源物、旁系同源物或同 源物。
[011引非编码区中的变体核巧酸序列
[0119] 硝酸盐吸收相关的核巧酸序列用于产生变体核巧酸序列,所述变体核巧酸序列具 有5 非翻译区、3 非翻译区或启动子区的核巧酸序列,其与相应的SEQ ID NO: 1的原始核 巧酸序列具有大约70%、75%、80%、85%、90%和95%同一性。运些变体然后与种质中的与 谷物颗粒质量和/或谷物颗粒产量相关的构成性状的天然变异相关联。该相关的变体用作 标记单倍型来选择所期望的性状。
[0120] OsBGl相关多肤的变体氨基酸序列
[0121] 产生了OsBGl相关多肤的变体氨基酸序列。在本实施例中,改变一个氨基酸。具体 而言,观察开放阅读框W确定适当的氨基酸改变。通过参考蛋白质比对(与其他直系同源基 因或来自各种物种的其他基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择据认为不处 于高选择压力下(不是高度保守的)且相当易于用具有类似化学特性(即,类似功能性侧链) 的氨基酸进行替换的氨基酸。利用蛋白质比对,可对适当的氨基酸进行改变。一旦鉴定出目 标氨基酸,即遵循本文所述的程序。使用运个方法产生出具有约70%、75%、80%、85%、 90%和95 %核酸序列同一性的变体。运些变体然后与种质中的与谷物颗粒质量和/或谷物 颗粒产量相关的构成性状的天然变异相关联。该相关的变体用作标记单倍型来选择所期望 的性状。
[01。] 用于构建核酸的合成方法
[0123] 本公开的分离的核酸也可W通过直接化学合成通过W下方法来制备,诸如用憐酸 Ξ醋方法(化rang,et al. , (1979)Meth.Enz;ymol .68:90-9(化rang等人,1979年,《酶学方 法》,第68卷,第90-99页));憐酸二醋方法(Brown,et al.,( 1979)Meth. Enzymol. 68:109-51 (Brown等人,1979年,《酶学方法》,第68卷,第109-151页));二乙基亚憐酷胺方法 (Beaucage ,et al(1981)Tetra 丄etts. 22(20): 1859-62(Beaucage等人,1981年,《四面体 通讯》,第22卷,第20期,第1859-1862页));如上的Beaucage等人所述的固相亚憐酷胺Ξ醋 方法,用例如如化e化am-VanDevanter,et al.,(1984)Nucleic Acids Res. 12:6159-68 (Nee化am化nDevanter等人,1984年,《核酸研究》,第12卷,第6159-6168页)所述的自动合 成仪,W及美国专利No.4,458,066的固相支撑方法。化学合成通常产生单链寡核巧酸。运可 通过与互补序列杂交或通过使用该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变为双链DNA。 技术人员将会认识到,虽然DNA的化学合成局限于约100个碱基的序列,但可通过连接较短 的序列来获得较长的序列。
[0124] UTR和密码子偏好性
[0125] 总体来说,已发现翻译效率受RNA的5'非编码或非翻译区(5'UTR)中的特定序列元 件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列化〇zak,(1987)Nucleic Acids Res. 15:8125 (Kozak ,1987年,《核酸研究》,第15卷,第81 25页))和5<G〉7甲基GpppG RNA帽结构 (Drummond,et al.,(1985)Nucleic Acids Res.13:7375(D;rummond等人,1985年,《核酸研 究》,第13卷,第7375页))。负元件包括稳定的分子内5 'UTR茎-环结构(Muesing,et al., (1987)Cell 48:691 (Muesing等人,1987年,《细胞》第48卷,第691页))和5'UTR中的AUG序列 或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao ,et al.,(1988)Mol. and Cel 1.Biol. 8: 284(Rao等人,1988年,《分子和细胞生物学》,第8卷,第284页))。因此,本公开 提供了用于调节异源编码序列的翻译的5 '和/或3 ' UTR区。
[012W 植物转化方法
[0127] 多种用于将外来基因引入植物中的方法是已知的并可用来将硝酸盐吸收相关的 多核巧酸插入植物宿主中,运包括生物学和物理学的植物转化方案。参见例如,Miki,et al"Procedure for Introducing Foreign DNA into Plantsin Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick and Thompson,eds.,CRC Press , Inc., Boca Raton,pp. 67-88 (1993) (M化i等人,"将外来DNA引入植物中的程序",《植物分子生物 学和生物技术方法》,Glick和化ompson编辑,波卡拉顿的CRC出版社,第67-88页,1993年)。 所选择的方法随宿主植物而变化,包括化学转染方法诸如憐酸巧介导的基因转移、微生物 介导的基因转移诸如农杆菌介导的基因转移化orsch et al.,(1985)Science 227:1229- 31化orsch等人,1985年,《科学》,第227卷,第1229-1231页))、电穿孔、显微注射和基因枪轰 山ο
[0128] 用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体W及体外培养方法是已知 的并可获得。参见例如Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation,"in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,supra,pp.89-119(Gruber等 人,"用于植物转化的载体",《植物分子生物学和生物技术方法》,出处同上,第89-119页)。
[0129]可通过一种或多种通常用于直接递送至细胞中的技术将分离的多核巧酸或多肤 引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植 物或双子叶植物),运种方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway,et al.,( 1986)Biotechniques 4:320-334(Crossway等人,1986年,《生物技术》,第4卷,第320- 334页)和美国专利 No. 6 ,300 ,543)、电穿孔(Riggs,et al. ,(1986) Proc. Natl. Acad. Sci . USA83:5602-5606(Riggs等人,1986年,《美国国家科学院院刊》,第83 卷,第5602-5606页))、直接基因转移(Paszkowski,et al. ,(1984化MB0 J.3:2717-2722 (化szkowski等人,1984年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第3卷,第2717-2722页))W及弹道 粒子加速(参见例如Sanford等人,美国专利No. 4,945,050; W0 91/10725;和McCabe,et al.,( 1988)Biotechnology6:923-926(McCabe等人,1988年,《生物技术》,第6卷,第923-926 页))。还可参见 Tomes,et al., "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment".pp.197-213in Plant Cell,Tissue and Organ Culture.Fundamental Methods .eds.Gamborg and Phillips .Springer-Verlag Berlin Heide化erg化w York,1995(Tomes等人,"通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞 中",第197-213页,载于《植物细胞、组织和器官培养:基本方法》,Gamborg和化i 11 ips编辑, 施普林格出版社柏林海德堡,纽约,1995年);美国专利No . 4,945,0505,736,369 (分生组 织);Weissinger'et al.,(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477(Weissinger等人,1988年, 《遗传学年评》,第22卷,第421-477页);Sanford,et al.,(1987)Pa;rticulate Science and Technology 5 : 27-37(Sanford等人,1987年,《颗粒科学与技术》,第5卷,第27-37页)(洋 葱);化;ristou,et al(1988)Plant Physiol. 87:671-674(Qiristou等人,1988年,《植物 生理学》,第87卷,第671-674页)(大豆);Datta,et al.,(1990)Biotechnology 8:736-740 (Datta等人,1990年,《生物技术》,第8卷,第736-740页)(水稻);Klein,et al. ,(1988) Proc.化tl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309化lein等人,1988年,《美国国家科学院院刊》,第 85卷,第4305-4309页)(玉米);Klein,et al.,(1988)Biotechnology 6:559-563化16111等 人,1988年,《生物技术》,第6卷,第559-563页)(玉米);W0 91/10725(玉米);Klein,et al., (1988)Plant I^ysiol. 91:440-444化lein等人,1988年,《植物生理学》,第91 卷,第440-444 页)(玉米);Ρ?〇πιπι,θ? al. , (1990)Biotechnology 8:833-839(Ρ?οπιπι等人,1990年,《生物技 术》,第8卷,第833-839页)和Gordon-Kamm,et al.,(1990)Plant Cell 2:603-618(Gordon- Kamm等人,1990年,《植物细胞》,第2卷,第603-618页)(玉米);Hooydaas-Van Slogteren and Hooykaas (1984)Na1:ure (Xondon) 311:763-764 (Hooydaas-Van Slogteren和Hooykaas, 1984年,《自然》(伦敦),第311卷,第763-764页);Bytebierm,et al .,( 1987) Proc.Natl. Acad. Sci . USA 84:5345-5349(Bytebier等人,1987年,《美国国家科学院院刊》, 第 84 卷,第 5345-5349 页)(百合科);De Wet, et al.,(1985)In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman,et al.,pp.197-209.Longman,NY(De Wet 等人,1985年,载于《胚珠组织的实验操作》,畑apman等人编辑,朗文出版社,纽约,第197- 209页)(花粉);Kaepple;r,et al.,(1990)Plant Cell Repo;rts9:415-418化aeppler等人, 1990年,《植物细胞报道》,第9卷,第415-418页);W及Kaeppler,etal.,( 1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566化aeppler等人,1992年,《理论与应用遗传学》,第84卷,第 560-566页)(晶须介导的转化);美国专利5,693,512(超声处理);0'化1111111,6*曰1., (1992冲1日111〇611 4:1495-1505(0'化1111111等人,1992年,《植物细胞》,第4卷,第1495- 1505页)(电穿孔);Li,et al.,(1993)Plant Cell R邱OTtsl2:250-255(Li等人,1993年, 《植物细胞报道》,第 12卷,第250-2
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