55页）W及Christou and Ford，（1995)Annals of Botany 75:407-413(化ristou和化rd，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页）（水 稻）；Os joda，et al.，（ 1996)NaUire Biotech. 14:745-750(0s joda等人，1996年，《自然生物 技术》，第14卷，第745-750页）；农杆菌介导的玉米转化(美国专利5，981，840);碳化娃晶须 方法(Frame，et al.，（ 1994)Plant J. 6:941-948(Frame等人，1994年，《植物杂志》，第6卷， 第941-948页））；激光方法(Guo,et al.,(1995)Physiologia Plantarum 93:19-24(Guo等 人，1995年，《植物生理学》，第93卷，第19-24页））；超声处理方法（Bao，et al.，（ 1997) 叫trasound in Medicine&Biology 23:953-959(Bao等人，1997年，《超声在医学和生物学 中的应用》，第 23 卷，第953-959 页）；Finer and Finer, (2000 化 ett Appl Microbiol.30: 406-10(Finer和。1116'，2000年，《应用微生物学通讯》，第30卷，第406-410页）；4111〇日}1，61 al.，（2001) J Exp Bot52 :1135-42(Amoah等人，2001年，《实验植物学杂志》，第52卷，第 1135-1142页））；聚乙二醇法化rens，et al.，（1982)Nature 296:72-77化rens等人，1982 年，《自然》，第296卷，第72-77页））；单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体可使用电穿 孔（Fromm, et al.,(1985)Proc.化tl .Acad. Sci .USA 82:5824-5828(Fromm等人，1985年， 《美国国家科学院院刊》，第82卷，第5824-5828页））和显微注射(Crossway，et al. ,(1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185(Crossway等人，1986年，《分子和普通遗传学》，第202卷，第 179-185页））转化，运些文献全部W引用的方式并入本文。
[0。0]农杆菌介导的转化
[0131] 将表达载体引入植物中的最广泛使用的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根瘤 农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.;rhizogenes)是植物病原性±壤细菌，其能遗传 转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基 因。参见例如Kado，（ 1991 )Crit.Rev.Plant Sci . 10: UKado，1991 年，《植物科学评论》，第 10 卷，第1页）。如下文献提供了有关用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的 描述:Gruber等人（出处同上）；Miki等人（出处同上）和Moloney,et al(1989)Plant Cell R巧orts 8:238(Molon巧等人，1989年，《植物细胞报道》，第8卷，第238页）。
[0132] 相似地，可将基因插入源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌各自的Ti或Ri质粒的T-DNA 区中。因而，可使用运些质粒，如上构建表达盒。已知许多控制序列，其在偶联至异源编码序 列并转化进宿主生物体中时，在原始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的 保真性。参见例如Benfey and 化ua,(1989)Science 244:174-81(Benfey和化ua，1989年， 《科学》，第244卷，第174-181页）。用于运些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各 种祀植物中的组成型叶特异性表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自姻脂氨酸合酶 基因(N0S)的启动子和终止子。N0S启动子和终止子存在于质粒PARC2中，该质粒可得自美国 典型培养物保藏中屯、，指定的ATCC存放号为67238。如果使用运样一种系统，则来自Ti或Ri 质粒的毒力(vir)基因也必须存在，或者与T-DNA部分一起，或者经由其中vir基因存在于单 独载体上的双元系统。运类系统、在其中使用的载体w及转化植物细胞的方法在w下专利 和文献中有描述：美国专利No. 4,658，082; 1986年10月1日提交的美国专利申请No. 913， 914,如在1993年11月16日公布的美国专利No. 5,262,306中引用的；和Simpson，et al.， (1986)Plant Mol. Biol. 6 :403-15( Simpson等人，1986年，《植物分子生物学》，第6卷，第 403-415页）（也在' 306专利中引用）中有所描述，所述文献全文均W引用方式并入本文。
[0133] -旦转化，可将运些细胞用于再生转基因植物。例如，可通过使该植物产生伤口， 然后将载体引入该伤口位点中来用运些载体感染整个植物。可使植物的任何部分产生伤 口，所述部分包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织诸如子叶组织或叶圆片用 运些载体接种，并在促进植物再生的条件下培养。可将根或苗用作植物组织的来源，所述根 或苗通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌(含有编码伏马毒素降解酶的基因）接种植物组织而 转化，W经由体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马毒素抗性转基因植物。再生植物组织 的此类方法的例子公开于化址 111，（1985)化6〇'.4991.661161.69:235-40(5}1曰}1111，1985年， 《理论和应用遗传学》，第69卷，第235-240页）；美国专利No. 4，658，082; Simpson等人，出处 同上；W及均于1986年10月1日提交的美国专利申请No. 913,913和No. 913,914,如公布于 1993年11月16日的美国专利No. 5，262，306所引用，将上述文献的全部公开内容W引用方式 并入本文。
[0134] 直接基因转移
[0135] 尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物 总体上对该基因转移模式而言是顽樹的，尽管最近已在水稻中获得了一定的成功化iei，et al.，（1994)The Plant Journal 6:271-82化iei等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第271- 282页））。已开发了植物转化的几种方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化 的替代方案。
[0136] 一般适用的植物转化方法是微抛射体(mi cropro jectile)介导的转化，其中DNA携 带在测量为约的微抛射体的表面上。用基因枪装置(biolistic device)将表达载体 引入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300-600m/s的速度，该速度足W穿透植 物细胞壁和膜（Sanford，et al .，（ 1987)Part. Sci . Technol. 5: 27(Sanford等人，1987年， 《颗粒科学与技术》，第5卷，第27页）；Sanford，（ 1988 )Trends Biotech 6: 299 (Sanford， 1988 年，《生物技术趋势》，第6卷，第 299页）；Sanford, (1990 )Physiol. Plant 79:206 (Sanford, 1990年，《植物生理学》，第79卷，第206 页）和Klein, et al .，（ 1992) Biotechnology 10:268化lein等人，1992年，《生物技术》，第10卷，第268页））。
[0137] 物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang,et al. , (1991)BioTechnology 9: 996 (Zang等人，1991年，《生物技术》，第9卷，第996页）中所述的对祀细胞的超声处理。或者， 脂质体或原生质球融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes，et al.，（1985) EMBO J.4:2731(Deshayes等人，1985年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第4卷，第2731页）和 Qiristou, et al. , (1987)P;roc.化tl. Acad. Sci . USA84:3962(Qiristou等人，1987年，《美国 国家科学院院刊》，第84卷，第3962页）。利用化Cl2沉淀、聚乙締醇或聚-k鸟氨酸直接将DNA 摄入原生质体中也已有报道。参见例如化in，et al.，（1985)Mol .Gen.Genet. 199:161化ain 等人，1985年，《分子和普通遗传学》，第199卷，第161页）和Draper，etal.，（1982)Plant Cell Physiol. 23:451 (Draper等人，1982年，《植物细胞生理学》，第23卷，第451页）。
[0138] 原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn，et al. ,(1990) Abstracts of the Vllth Int'1.Congress on Plant Cell and Tissue Culture lAPTC, A2-38，p. 53(Donn等人，1990年，《第Vn届植物细胞与组织培养lAPTC会议摘要》，A2-38，第 53页）；D'化lluin，et al.，（1992)Plant Cell4:1495-505(D'化Iluin等人，1992年，《植物 细胞》，第4卷，第 1495-1505 页）和Spencer，et al.，（1994)Plant Mol. Biol. 24:51-61 (Spencer等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第51-61页）。
[0。9] 1.基于多核巧酸的方法:
[0140] 在本公开的一些实施例中，用表达盒转化植物，该表达盒能够表达抑制本公开的 OsBGl表达的多核巧酸。本文所用的术语"表达"指基因产物的生物合成，包括所述基因产物 的转录和/或翻译。例如，出于本公开的目的，能够表达多核巧酸的表达盒(所述多核巧酸抑 审IJ至少一种硝酸盐摄取相关的多肤的表达)是能够产生RNA分子的表达盒(所述RNA分子抑 制本公开的至少一种硝酸盐摄取相关的多肤的转录和/或翻译）。蛋白质或多肤从DNA分子 的"表达"或"产生"指该编码序列的转录和翻译W产生该蛋白质或多肤，而蛋白质或多肤从 RNA分子的"表达"或"产生"指该RNA编码序列的翻译W产生蛋白质或多肤。
[0141] 可抑制OsBGl表达的多核巧酸的例子在下面给出。
[01创 i.有义抑制/共抑制
[0143] 在本公开的一些实施例中，OsBGl表达的抑制可通过有义抑制或共抑制来获得。对 于共抑制，将表达盒设计为表达运样的RNA分子，该RNA分子有义"取向对应于编码OsBGl 的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该共 抑制表达盒转化的多个植株系进行筛选W鉴别那些显示出对硝酸盐摄取相关的多肤表达 的最大抑制的植株。
[0144] 用于共抑制的多核巧酸可对应于编码硝酸盐摄取相关多肤的序列的全部或部分、 OsBGl转录物的5'和/或3'非翻译区的全部或部分、或者编码OsBGl的转录物的编码序列和 非翻译区二者的全部或部分。在其中该多核巧酸包含硝酸盐摄取相关多肤的编码区的全部 或部分的一些实施例中，将表达盒设计为消除该多核巧酸的起始密码子，使得不会翻译出 蛋白质产物。
[0145] 共抑制可用来抑制植物基因的表达W产生对于由运些基因编码的蛋白质而言具 有不可检测的蛋白质水平的植物。参见例如化〇in，et al.，（2002)Plant Cell 14:1417- l432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页）。共抑制还可用来抑制同一 植物中的多种蛋白质的表达。参见例如美国专利No. 5，942，657、使用共抑制来抑制植物中 的内源性基因的表达的方法在W下文献和专利中有描述：Flavell，et al.，（1994) Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA91:3490-3496 (Flave 11 等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第 91卷，第3490-3496页）；Jorgensen，et al.，（1996)Plant Mol.Biol.31:957-973 (Jorgensen等人，1996年，《植物分子生物学》，第31卷，第957-973页）；Johansen and Carrington, (2001 )Plant F*hysiol. 126:930-938(Johansen和化rrington，2001 年，《植物 生理学》，第126卷，第930-938页）；化oin，et al.，（2002)Plant Cell 14:1417-1432(^oin 等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页）；Stout jesdUk，et al.，（2002)Plant 曲 ysiol. 129 :1723-1731 (Stout jesdijk 等人，2002年，《植物生理学》，第 129卷，第 1723- 1731 页）；化，et al.，（2003)Phytochemistry 63:753-763(化等人，2003年，《植物化学》，第 63卷，第 753-763页）W及美国专利No. 5，034，323、No. 5，283，184和No. 5，942，657，将运些文 献和专利的每一个W引用方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3 ' 位置和多腺巧酸化信号的5'位置包括poly-dT区来提高。参见第2002/0048814号美国专利 公布，将其W引用的方式并入本文。通常，运种核巧酸序列与内源性基因的转录物的序列具 有基本上的序列同一性，优选的是大于约65%的序列同一性，更优选的是大于约85%的序 列同一性，最优选的是大于约95 %的序列同一性。参见第5，283，184号和第5，034，323号美 国专利，将它们W引用的方式并入本文。
[0146] ii.反义抑制
[0147] 在本公开的一些实施例中，对硝酸盐摄取相关多肤表达的抑制可通过反义抑制获 得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达与编码该硝酸盐摄取相关多肤的信使RNA的全部或 部分互补的RNA分子。该反义RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用反义 抑制表达盒转化的多个植株系进行筛选W鉴别那些显示出对硝酸盐摄取相关多肤表达的 最大抑制的植株。
[014引 iii.双链RNA干扰
[0149] 在本公开的一些实施例中，对OsBGl表达的抑制可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获 得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部 分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源性信使RNA的表达的抑制。
[0150] 有义和反义分子的表达可通过将表达盒设计为同时包含有义序列和反义序列来 实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。使用dsRNA干扰来抑制内源 性植物基因的表达的方法在W下文献和专利中有描述：Waterhouse, et al. ,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci . USA 95:13959-13964(Waterhouse等人，1998年，《美国国家科学院院 刊》，第95卷，第 13959-13964页），Liu，et al.，（2002)Plant 曲ysiol. 129:1732-1743(Liu 等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第 1732-1743页）W及W099/49029、W0 99/53050、W0 99/61631和WO 00/49035，将每个文献和专利W引用方式并入本文。
[0巧。i V.发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰
[0152] 在本公开的一些实施例中，对OsBGl表达的抑制可通过发夹RNA化pRNA)干扰或含 内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。运些方法在抑制内源性基因表达方面是高度有效 的。参见Waterhouse and Helliwell, (2003)化t. Rev .Genet. 4: 29-38(Wate;rhouse和 化11 iwel 1，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)及其中引用的参考文献。
[0153] 对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达运样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成 包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于编码要对其表达进行 抑制的基因的内源性信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的 反义序列。或者，碱基配对茎区可对应于控制待抑制的基因的表达的启动子序列的一部分。 因此，该分子的碱基配对茎区通常确定了 RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源性基因 表达中很高效，它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。参见例如畑uang and Meyerowitz (2000)Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA 97:4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家 科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页）；Stoutjesdi jk，et al .，（2002)Plant 曲 ysiol. 129 :1723-1731 (Stout jesdijk 等人，2002年，《植物生理学》，第 129卷，第 1723- 1731页）W及Waterhouse and Helliwell, (2003)化t .Rev.Genet .4: 29-38(Wate;rhouse和 化11 iwel 1，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页）。使用hpRNA干扰来抑制或沉默 基因表达的方法在例如W下文献和专利中有描述：Chuang and Meye;rowitz,(2000) Proc.化tl. Acad. Sci . USA97 :4985-4990(化uang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院 院刊》，第97卷，第4985-4990页）；Stout jesdi_jk，et al.，（2002)Plant I^ysiol. 129:1723- 1731 (Stout jesdijk 等人，2002年，《植物生理学》，第 129卷，第 1723-1731页）；Waterhouse and Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综 述遗传学》，第4卷，第29-38页）；Pandolfini et al.,BMC Biotechnology 3:7(Pandolfini 等人，《BMC生物技术》，第3卷，第7页）W及美国专利申请公布No. 2003/0175965，每个文献和 专利W引用方式并入本文。hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法已在W下 文献中描述：Panstruga，et al.，（2003)Mol.Biol.R邱.30:135-140(Panstruga等人，2003 年，《分子生物学报道》，第30卷，第135-140页），所述专利和文献W引用方式并入本文。
[0154] 对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含 子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环 的大小在剪接后最小化，运提高了干扰的效率。参见例如，Smith，et al.，（ 2000)化ture 407:319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页）。事实上，Smith等人展示 了使用化pRNA介导的干扰百分之百抑制了内源性基因表达。使用ihpRNA干扰来抑制内源性 植物基因的表达的方法例如在W下文献和专利中有描述：Smi th，et a 1.，（ 2000) Nature 407:319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页）；Wesl巧，et al. ,(2001) Plant J.27:581-590(Wesl巧等人，2001 年，《植物杂志》，第27卷，第581-590页）；Wang and Waterhouse, (2001 )Qi;r;r. Opin. Plant Biol. 5:146-150(Wang和Waterhouse，2001年，《植物 生物学新见》，第5卷，第146-150页）；Wate;rhouse and Helliwell(2003)化t.Rev.Genet.4: 29-38 (Waterhouse和Hell iwell ,2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页）； Helliwell and Waterhouse,(2003)Methods 30:289-295巧elliwell和Waterhouse,2003 年，《方法》，第30卷，第289-295页）W及美国专利申请公布No. 2003/0180945，每个文献和专 利W引用方式并入本文。
[0155] 还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内 源性RNA。在运个实施例中，该反义和有义序列在运样的环序列的旁侧，该环序列包含对应 于祀基因的内源性信使RNA的全部或部分的核巧酸序列。因而，是环区决定了 RNA干扰的特 异性。参见例如W002/00904;Mette，etal.，（2000化MB0J 19:5194-5201(Mette等人，2000 年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷，第5194-5201页）；Matzke，et al.，（2001) Qirr.Opin.Genet.Devel. 11:221-227(Matzke等人，2001年，《遗传学与发育新见》，第11卷， 第221-227页）；Scheid，et al.，（2002)Proc.化tl.Acad.Sci.，USA 99:13659-13662 (Scheid等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第13659-13662页）；Aufsaftz，et al.，（2002)Proc.化t'l.Acad.Sci.99(4):16499-16506(Aufsaftz等人，2002年，《美国国家 科学院院刊》，第99卷，第4 期，第16499-16506页）；Sijen，et al.，Curr.Biol. (2001)11: 436-440(Sijen等人，《当代生物学》，2001年，第11卷，第436-440页）），运些文献和专利W引 用方式并入本文。 邮]V.扩增子介导的干扰
[