0157]扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有祀基因的全部或部分但通常 不含有该天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物 指导其自身的复制。由该扩增子产生的转录物相对于祀序列（即硝酸盐摄取相关多肤的信 使RNA)可W是有义或反义的。利用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法例如在如下文 献中有描述:Angell and Baulcombe，（1997化MBO J.16:3675-3684(AngeU和Baulcombe， 1997年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第16卷，第3675-3684页）、Angell and Baulcombe， (1999)Plant J. 20:357-362(Angel 1 和Baulcombe，1999年，《植物杂志》，第20卷，第357-362 页）W及美国专利齡.6,646,805，运些文献和专利的每一个^引用的方式并入本文。
[015引 vi.核酶
[0159] 在一些实施例中，由本公开的表达盒表达的多核巧酸是信使RNA特异性的催化性 RNA或具有信使RNA特异性的核酶活性。运个方法例如在美国专利No. 4，987，071中进行了描 述，将该专利W引用方式并入本文。
[0160] vii.小干扰 RNA 或微 RNA
[0161] 在本公开的一些实施例中，OsBGl表达的抑制可通过表达编码微RNA(miRNA)的基 因经由RNA干扰来获得。miRNA是由约22个核糖核巧酸组成的调控剂，miRNA在抑制内源性基 因表达方面很高效。参见，例如化vier，et al. ,(2003)化Uire 425:257-263(化vier等人， 2003年，《自然》，第425卷，第257-263页），该文献W引用方式并入本文。
[0162] 对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达在内源性miRNA基因上建模的RNA分子。该 miRNA基因编码可形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与另一内源性基因（祀序列)互补的 22核巧酸序列。为抑制硝酸盐摄取相关表达，所述22个核巧酸的序列选自硝酸盐摄取相关 转录物序列并包含所述硝酸盐摄取相关序列W有义取向的22个核巧酸和与所述有义序列 互补的相应反义序列的21个核巧酸。miRNA分子在抑制内源性基因的表达上很高效，它们诱 导的RNA干扰被植物后代继承。
[0163] 2.基因表达白勺基于多肤白勺抑审。
[0164] 在一个实施例中，所述多核巧酸编码与编码OsBGl的基因结合的锋指蛋白，从而导 致所述基因的表达降低。在特定实施例中，该锋指蛋白结合至硝酸盐摄取相关基因的调控 区。在其他实施例中，该锋指蛋白结合至编码OsBGl的信使RNA并防止其翻译。选择被锋指蛋 白祀向的位点的方法已例如在美国专利No.6,453,242中进行了描述，利用锋指蛋白来抑制 植物中的基因表达的方法例如在美国专利申请公布No. 2003/0037355中进行了描述，运些 专利中的每一个W引用方式并入本文。
[01化]3.蛋白质活性的基于多肤的抑制
[0166] 在本公开的一些实施例中，多核巧酸编码结合至本公开多肤的抗体。抗体在植物 细胞中的表达W及通过表达并将抗体结合至植物细胞中的蛋白质来抑制分子途径是本领 域所熟知的。参见例如Conrad and Sonnewald, (2003)化 1:ure Biotech. 21: 35-36(Conrad 和Sonnewald，2003年，《自然生物技术》，第21卷，第35-36页），其W引用方式并入本文。
[0167] 4.基因破坏
[0168] 在本公开的一些实施例中，通过破坏编码硝酸盐摄取相关多肤的基因，降低或消 除OsBGl的活性。可通过本领域已知的任何方法来破坏编码硝酸盐摄取相关多肤的基因。例 如，在一个实施例中，通过转座子标签法破坏所述基因。在另一个实施例中，通过利用随机 诱变或定向诱变来对植物进行诱变处理并选择具有减低了的氮利用活性的植物来破坏所 述基因。
[01~]i.转座子标签法
[0170] 在本公开的一个实施例中，使用转座子标签法降低或消除一种或多种硝酸盐摄取 相关多肤的硝酸盐摄取相关活性。转座子标签法包括在内源性硝酸盐摄取相关基因内插入 转座子W降低或消除所述硝酸盐摄取相关多肤的表达。"硝酸盐摄取相关基因"意指编码根 据本公开的OsBGl的基因。
[0171] 在该实施例中，通过在编码硝酸盐摄取相关多肤的基因的调控区或编码区内插入 转座子来降低或消除一种或多种硝酸盐摄取相关多肤的表达。处于硝酸盐摄取相关基因的 外显子、内含子、5'或3'非翻译序列、启动子或任何其他调控序列内的转座子可用于降低或 消除所编码硝酸盐摄取相关多肤的表达和/或活性。
[0172] 用于对植物中的特定基因进行转座子标签的方法是本领域所熟知的。参见例如 Maes，et al.，（1999)Trends Plant Sci.4:90-96(Maes等人，1999年，《植物科学趋势》，第4 卷，第90-96页）；Dha;rmapu;ri and Sonti,(1999)FEMS Microbiol.Lett. 179:53-59 (Dharmapuri和Sonti，1999年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第179卷，第53-59 页）；Meissner，et al.，（2000)Plant J. 22: 265-274(Meissner等人，2000年，《植物杂志》， 第22卷，第265-274页）；I^ogat，et al.，（2000) J. Biosci . 25:57-63(曲ogat等人，2000年， 《生物科学杂志》，第25卷，第57-63页）；￥3化的，（2000)加''.化111.?1311181〇1.2:103-107 (Wa化ot，2000年，《植物生物学新见》，第2卷，第 103-107页）；Gai，et al.，（2000)Nucleic Acids Res. 28:94-96(Gai等人，2000年，《核酸研究》，第28卷，第94-96页）；Fitzmaurice，et al.，（1999)Genetics 153:1919-1928(Fitzmaurice等人，1999年，《遗传学》，第 153卷，第 1919-1928页）。此外，用于选择选定基因中的Mu插入序列的TUSC方法已在如下文献中进行 了描述:Bensen，et al.，（1995)Plant Cell 7:75-84(Bensen等人，1995年，《植物细胞》，第 7卷，第75-84页）；Mena，et al.，（1996)Science 274:1537-1540(Mena等人，1996年，《科 学》，第274卷，第1537-1540页)和美国专利No. 5，962，764，运些文献和专利的每一个W引用 的方式并入本文。
[017引 ii.活性降低的突变体植物
[0174] 用于降低或消除植物中的内源性基因的表达的另外方法也是本领域已知的，并且 可类似地应用于本公开。运些方法包括其他形式的诱变，诸如甲横酸乙醋诱导的诱变、缺失 诱变和快中子缺失诱变，快中子缺失诱变W反向遗传学方式(使用PCR)用于鉴别其中内源 性基因已缺失的植物株系。运些方法的例子参见化shima,et al. , (1998)Vi;rology 243: 472-481(0hshima 等人，1998年，《病毒学》，第 243卷，第472-481页）；0kubara，et al.， (1994)Genetics 137:867-874(0kubara等人，1994年，《遗传学》，第 137卷，第867-874页）； W及Quesada,et al. , (2000)661161:;[。3154:421-436(01163日(1日等人，2000年，《遗传学》，第 154卷，第421-436页）；运些文献的每一个W引用的方式并入本文。此外，一种用于筛选化学 诱导的突变的快速且可自动化的方法T化LING(祀向诱导基因组局部突变）也适用于本公 开，该方法利用变性HPLC或者对选定的PCR产物的选择性内切核酸酶消化。参见Me化1 lum， et al. ,(2000)化t.Biotechnol.l8:455-457(McCallum等人，2000年，《国家生物科技》，第 18卷，第455-457页），所述文献W引用方式并入本文。
[0175] 影响基因表达或干扰所编码的蛋白质的功能（增加的氮利用活性）的突变是本领 域所熟知的。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基的突变在抑制所编 码的蛋白质的活性方面是特别有效的。植物硝酸盐摄取相关多肤的、适于W消除硝酸盐摄 取相关活性为目标进行的诱变的保守残基已得到描述。可根据熟知的程序分离运种突变 体，并且可通过遗传杂交对不同硝酸盐摄取相关基因座中的突变进行堆叠。参见例如 Gruis，et al.，（2002)Plant Cell 14:2863-2882(Gruis等人，2002年，《植物细胞》，第 14 卷，第 2863-2882页）。
[0176] 在本公开的另一个实施例中，显性突变体由于基因倒位和重复基因座的重组可用 于引发RNA沉默。参见例如Kusaba，et al.，（2003)Plant Celll5:1455-1467化usaba等人， 2003年，《植物细胞》，第15卷，第1455-1467页）。
[0177] 本公开涵盖用于降低或消除一种或多种硝酸盐摄取相关多肤的活性的另外方法。 用于改变或突变植物中的基因组核巧酸序列的其他方法的例子是本领域已知的，包括但不 限于使用RNA: DNA载体、RNA: DNA突变载体、RNA: DNA修复载体、混合双链寡核巧酸、自互补 RNA:DNA寡核巧酸W及重组工程寡核碱基（recombinogenic oligonucleobase)。运种载体 和使用方法是本领域已知的。参见例如第5,565,350号美国专利;第5,731，181号美国专利； 第5,756,325号美国专利;第5,760,012号美国专利;第5,795,972号美国专利和第5,871， 984号美国专利，将运些专利中的每一个W引用的方式并入本文。另参见W0 98/49350、W0 99/07865、W099/25821和Beetham，et al.，（1999)Proc.化tl.Acad.Sci.USA 96:8774-8778 (Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第8774-8778页）；将运些文献和专 利的每一个W引用方式并入本文。
[017引 Vi.调节生殖组织发育
[0179] 提供了用于调节生殖组织发育的方法。在一个实施例中，提供了用于调节植物中 的花发育的方法。所谓"调节花发育"意指与其中硝酸盐摄取相关多肤的活性或水平还未受 调节的对照植物相比，植物的生殖组织的结构的任何改变。"调节花发育"还包括与其中硝 酸盐摄取相关多肤的活性或水平未受调节的对照植物相比，植物生殖组织发育的时刻的任 何改变（即花发育时刻的延迟或提前）。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化:生殖器 官的尺寸、形状、数目或位置，运些结构形成的发育时间段，或者维持或发展经过开花过程 的能力。微观改变可包括构成生殖器官的细胞的类型或形状的变化。
[0180] -般来讲，修改或改变宿主内源性基因组DNA的方法是可用的。运包括改变宿主天 然DNA序列或预先存在的转基因序列，所述转基因序列包括调控元件、编码序列和非编码序 列。运些方法也可用于使核酸祀向基因组中预工程化的祀标识别序列。例如，本文所述的经 遗传修饰的细胞或植物使用"定制"或工程化的内切核酸酶(诸如大范围核酸酶)生成，所述 大范围核酸酶的产生用于修饰植物基因组(参见例如W0 2009/114321 ;Gao et al. (2010) Plant Journal l:176-187(Gao等人，2010年，《植物杂志》，第1卷，第176-187页））。另一个 定点工程化通过使用与限制性酶的限制特性结合的锋指结构域识别。参见例如，Urnov，et al .，（2010)化t Rev Genet. 11 (9):636-46化rnov等人，2010年，《自然综述遗传学》，第11 卷，第9期，第636-646页）；amkla，et al.，（2009)化Uire 459(7245) :437-41(5}1址1日等人， 2009年，《自然》，第459卷，第7245期，第437-441页）。类转录激活因子(TAL)效应物-DNA修饰 酶(TALE或TALEN)也用于植物基因组中进行工程化改变。参见例如US20110145940，Cermak et al.，（2011)Nucleic Acids Res.39(12)(Cermak等人，2011 年，《核酸研究》，第39卷，第 12期）和Boch，et al.，（2009)Science 326(5959): 1509-12(Boch等人，2009年，《科学》，第 326卷，第5959期，第1509-1512页）。也可W使用细菌类型II CRISPR(成簇的规律间隔的短 回文重复序列）/Cas(CRISPR相关）系统进行植物基因组的位点特异性修饰。参见例如， Be化aj et al.，（2013)，Plant Methods 9:39(Be化aj等人，2013年，《植物方法》，第9卷，第 39页）；CRISPR/Cas系统允许由可定制的小型非编码RNA引导基因组DNA的祀向切割。基于 BG1编码序列、直系同源物/同源物的多肤序列和基因组DNA序列的公开内容，可容易地进行 定点诱变，W生成表达更高水平的内源性BG1多肤或其直系同源物的植物。
[0181] 还涵盖对于本文所公开的或所述实施例的BG1多肤或对于其变体或片段的抗体。 本公开的抗体包括多克隆和单克隆抗体W及它们的片断，所述片断保留了其与本文所公开 的BG1多肤结合的能力。抗体、单克隆抗体或其片段如果能够与分子发生特异性反应从而使 该分子与该抗体、单克隆抗体或其片段结合，则被认为能够结合该分子。术语"抗体"（Ab)或 "单克隆抗体"（Mab)意在包括能够结合半抗原的完整分子W及其片段或结合区或域(诸如 例如，Fab和F(ab). sub. 2片段）。此类片段通常由蛋白质水解裂解(诸如木瓜蛋白酶或胃蛋 白酶)产生。或者，半抗原结合片段可通过应用重组DNA技术或通过合成化学来产生。用于制 备本公开的抗体的方法是本领域公知的。例如参见Antibodies,A LaboratoiT Manual,Ed 化rlow and David Lane(eds.)Cold Spring 化rbor Laboratory,N.Y. (1988)(《抗体：实 验室手册》，Ed化rlow和化vid Lane编辑，纽约冷泉港实验室，1988年）W及其中引用的参 考文献。说明免疫学一般原理的标准参考著作包括:Klein, J. Immunology :The Science of Cell-Noncell Discrimination John Wil巧&Sons，N.Y. (1982KKlein，J，《免疫学：细胞- 非细胞识别科学》，约翰威利父子出版公司，纽约，1982年）；Dennett ,et al. ,Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,N.Y. (1980)(Dennett等人，单克隆抗体，《杂交瘤:生物学分析的新尺度》，普莱南出版社，纽约， 1980年似及Campbell, "Monoclonal Antibody TechnologyIn Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Vol.13,Burdon,et al.,(eds.),Elsevier, Amsterdam!； 1984) (Campbell，"单克隆抗体技术"，载于《生物化学和分子生物学实验技术》， 第13卷，Burdon等人编辑，爱思唯尔出版社，阿姆斯特丹，1984年）。另参见W下各号美国专 利：4，196,265、4,609,893、4,713,325、4,714,681、4,716，111、4,716，117和4,720,459。 PtIP-50多肤或PtIP-65多肤抗体或其抗原结合部分可通过多种技术产生，包括常规的单克 隆抗体方法，例如Kohler and Milstein，（1975)NaUire 256:495化ohler和Milstein，1975 年，《自然》，第256卷，第495页）的标准体细胞杂交技术。也可采用用于产生单克隆抗体的其 他技术，诸如B淋己细胞的病毒转化或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。 用于分离供融合用的免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨 髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。本公开的抗体和单克隆抗体可通过将本文所公开的BG1 多肤用作抗原来制备。
[0182] 提供了用于在样品中检测本文所公开的BG1多肤的存在或检测编码本文所公开的 BG1多肤的核巧酸序列的存在的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒提供了基于抗体的试剂 W用于检测组织样品中的本文所公开的BG1多肤的存在。在另一个实施例中，该试剂盒提供 了可用于检测编码本文所公开的BG1多肤的一个或多个多核巧酸的存在的标记核酸探针。 该试剂盒连同执行检测方法的适当试剂和对照W及试剂盒使用说明一起提供。
[0183] 如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的花发育的适当启动子。用 于该实施例的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗偏好的启动子W及花序 偏好的启动子。
[0184] 所关注基因可反映设及作物开发的那些的商业市场和利益。所关注的作物和市场 在变化，随着发展中国家开放了世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农 学性状和特性诸如产量和杂种优势的理解逐渐深入，选择进行转化的基因会相应变化。所 关注基因的大体类别包括例如设及信息的那些基因（诸如锋指）、设及通信的那些基因（诸 如激酶)和设及看家的那些基因（诸如热休克蛋白）。转基因的更具体类别例如包括编码对 农学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、巧粒特性和商业产品重要的性状的基因。 一般而言，所关注基因包括设及油、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些基因 W及影响 仁大小、薦糖载量等的那些基因。
[0185] 在某些实施例中，可将本公开的核酸序列与所关注的其他多核巧酸序列结合（"堆 叠"）使用，W便产生具有所需表型的植物。
[0186] 参考如下非限制性实例可更好地理解本公开。本领域技术人员将会理解，可W在 不脱离本文所公开的并受权利要求书保护的本公开的实质和范围的情况下实施本公开的 其他实施例。
[0187]
[01则实例l-Bgl-D突变体表现出增大的谷物颗粒尺寸表型
[0189] 为了更深入地了解控制水稻颗粒尺寸的基因网络，在大量的T-DNA水稻突变体中 发现了具有不同种子尺寸的多个突变体，所述T-DNA水稻突变体是通过用农杆菌介导的转 化(Ma et al .，2009，J. Genet.GenomiCS，36，267-276(Ma等人，2009年，《遗传学与基因组学 杂志》，第36卷，第267-276页））对水稻（日本晴水稻（0;ryza sativa L. cv.Nipponbare))进 行转化而获得的。鉴定并表征它们中的一者，即大粒显性突变体(bgl-D)，一种具有显著增 大的谷物颗粒尺寸和谷物颗粒重量的显性水稻突变体。与野生型日本晴水稻（Oryza Sativa L.spp.Japonica)相比，bgl-D显示在营养生长期和生殖期两者中的植株高度增加 并且器官尺寸增大（图1)。在发芽后第屯天，观察到bgl-D突变体加速生长，与野生型植株相 比，其具有显著伸长的叶銷（图1A和图13)。进入生殖期和营养生长期之后，野生型与bgl-D 的形态差异变得更明显。bgl-D的叶大于野生型植株的叶，并且bgl-D突变体显示节间伸长 改变，运导致植株高度增加（图1B和图1C)。有趣的是，bgl-D显示具有更长的穗和更大的谷 物颗粒表型（图1D、图化和图1F)，运些性状与水稻产量密切相关。在开花之前检验稻壳的横 截面，发现bgl-D中出现数量和体积增大的薄壁细胞（图2)，从而导致谷物颗粒宽度增大。用 扫描电镜(SEM)观察到的颖壳的纵向剖面显示bgl-D中的表皮细胞比野生型的表皮细胞要 长（图14)。另外，还比较通过测量鲜重和干重获得的巧粒灌浆速率。受精15天后，bgl-D的鲜 重和干重均显著高于野生型的鲜重和干重，在受精后约25天该差值达到最大值（图15)。基 于运些结果，很可能bgl-D突变体中谷物颗粒尺寸增大和谷物颗粒重量的增加主要是由谷 物颗粒宽度、长度增大和巧粒灌浆速率提高所致。表A1示出了 bgl-D和野生型植株的成熟植 株的农学性状的比较。
[0190] 植物材料和生长条件:Bgl-D突变体最初是从我们在日本晴梗稻（SSP japonica) 背景中的T-DNA插入突变体库中鉴定得到的。所有成熟植株均在北京或海南的稻田中在自 然条件下生长。就植物激素处理而言，将发芽的种子放置在浮置于1/2MS上的无底96孔板上 并移至具有1化光照/1化黑暗循环的生长室(28°〇。7天后对幼苗进行取样和处理。
[0191] 表A1.野生型和Bgl-D植物的农学性状。
[0192]
[0193] 对成熟植株进行农学性状分析。结果表示为括号中所示的几组尺寸的平均值± SD，（n = 30)。星号表示通过学生t检验确定的野生型和Bgl-D植物之间差异的显著性。** 0.001 <P<0.01，林冲 <0.001。
[0194] 表A2.下面示出了稻田的产量试验。
[0195]
[0196] 种植密度为20cmX20cm，每小块地的面积为15m2。数据是通过在中国北京自然条 件下对块区中的植株采用Ξ次平行测定计算获得的。
[0197] 实例2 - BG1的分子克隆和表征
[0198] 通过遗传学分析，用T-DNA插入序列共分离bgl-D的表型，并且T1代的分离比率为 大约3:1，运反映了 T-DNA在bgl-D突变体的单个基因座处插入。此外，不管bgl-D用作父本还 是母本，bgl-D的子代均表现为大颗粒表型，运表明Bgl为通过BG1的激活而产生的显性突变 体(表S1)。
[0199] 使用已知方法，通过Site-Finding PCR法基于热不对称交错式PCR(TA化-PCR)克 隆T-DNA 3 ' -旁侧序列。序列分析显示，基因0s03g0175800位于T-DNA插入序列的下游0.8kb 处。0s03g0175800的表达水平比在野生型植株中的水平提高了约10倍（图3)