100和低剂量的他克莫司组合⑶133干细胞在 改善创伤愈合中的关键作用。进行谱系示踪研究以确认CD 133干细胞在创伤愈合中的关键 作用。使用含有Ro sa26GFP报告等位基因（CD 133+/CL X mTmG后代）的成年CD 133+/C-L小鼠。 在创伤前7天，用他莫昔芬诱导CreERT2活性（图6a)。在该小鼠模型中，CD133祖细胞为IacZ 阳性，然而CD 133后代为GFP阳性。如其他人所报道的(Charruy er等，2012 )，仅在未受损的小 鼠皮肤的毛囊中观察到LacZ阳性细胞和GFP阳性细胞(图6b)。
[0128] 在创伤之后5天，IacZ阳性细胞和GFP阳性细胞在肉芽组织中增加（图10;上图和中 图）。与第1组相比，在第2组和第3组小鼠中恢复的肉芽组织中的IacZ阳性细胞和GFP阳性细 胞的数目显著较高，但是最大数目的IacZ和GFP阳性细胞发现于第4组小鼠的肉芽组织中 (图10)。在第1组、第2组和第3组中，大多数LacZ阳性细胞在第15天时消失，而它们的后代 ⑶133GFP阳性细胞保留在愈合组织中（图6c)。然而，在第4组小鼠中，新生成的脉管系统、表 皮和毛囊保持LacZ阳性和GFP阳性（图6d)。这些结果暗示在药理上动员的⑶133干细胞以及 它们的后代为皮肤再生的主要贡献者。
[0129] _
[0130] AMD3100(普乐沙福或Mozobil)为CXCR4的直接拮抗剂并且已经在临床上用于将人 的造血干细胞驱逐出BM，而进入外周血，在那，它们可以恢复并保存直至完成烧蚀辐射和/ 或化学疗法。也发现AMD3100可应用于组织损伤的修复(几」〇等，2010、2013;附811加 11^等， 2012) 。单剂量的注射增强BM来源的内皮祖细胞(EPC)的动员，所述动员与小鼠心肌梗死之 后车父快速的新血管形成以及功能恢复相关(Jujo等，2010)。在缺血/再灌注损伤(Ju jo等， 2013) 之后，急性注射以内皮一氧化氮合酶依赖性方式将促血管生成的BM细胞重新分配至 缺血性心肌并促进小鼠心脏功能的恢复。AMD3100的单一局部施用促进患糖尿病的小鼠的 创伤愈合(Nishimura等，2012)，这与增加细胞因子产生、增加骨髓EPC的数目以及增加成纤 维细胞和单核细胞/巨噬细胞的活性相关。血管生成和血管发生均增加（Nishimura等， 2012)。我们的结果证实并显著扩展了那些发现。事实上，AMD3100单一疗法将创伤愈合增强 至中等程度，这与干细胞至创伤部位的较温和的募集相关（图3b)。我们的重要贡献是以下 发现:将低剂量的他克莫司与AMD3100组合在我们的全皮层皮肤切除的啮齿类模型中产生 更多积聚的干细胞以及更为迅速再生的正常皮肤。以免疫抑制剂量的1/10给定的他克莫司 与AMD3100在干细胞至血流和创伤的募集中具有显著的协同效应，所述干细胞特别是携带 组合的单核细胞和SDF-I标志物的那些干细胞。
[0131] 他克莫司为有效的免疫抑制药物，但令人惊讶地，他克莫司的亚免疫抑制剂量也 增强细胞再生和修复(FrancaviIla等，1989;Carroll等，1994;Gold，1997)。低剂量(0.1 mg kg^1)但非标准免疫抑制剂量(1.0 mg kg<)的他克莫司促进大鼠中结肠吻合的治愈(Kiyama 等，2002)。他克莫司治疗促进患有扁平苔藓和糖尿病的75岁妇女的下肢皮肤溃疡的愈合 (]\^1166 2008)』3丨等(83丨等，2010)显示低（20即1111-1)剂量而非高（2000即1111-1)剂量的 他克莫司体外治疗使BM-来源的巨噬细胞的极化向活跃的M2巨噬细胞表型倾斜。在我们的 研究中，我们还证明低剂量的他克莫司增强与在手术后第5天显著增加皮肤创伤中产生 SDF-I的巨噬细胞的数目相关的皮肤创伤愈合。来自此类细胞的信息促成其它炎性细胞和 血小板产生的多个信息，其召集细胞，从而致使治愈。因此，AMD3100从干细胞的BM生态位强 "推"干细胞以及低剂量的他克莫司增强创伤部位的因子强"拉"循环的干细胞，最好地解释 了用双重AMD3100/他克莫司治疗使干细胞在创伤部位较大积聚以及更迅速恢复正常皮肤 的原因。
[0132] 双重药物募集干细胞与创伤中VEGF、b-FGF和HGF mRNA的表达升高相关。有趣地 是，抗-HGF抗体与⑶31+细胞共染色，所述⑶31+细胞还为⑶133+(图5c) AGF具有许多刺激 作用并且其也已经显示是造血干细胞和祖细胞增殖和分化的有效调节剂（Nishino等， 1995)以及血管生成的强大刺激物(Ding等，2003)。也已经显示HGF在创伤-愈合模型中对 MSC产生强的趋化作用(Neuss等，2004)。因此，双重药物治疗促进产生SDF-I的巨噬细胞的 积聚，所述巨噬细胞致使更多的干细胞募集。反过来，HGF以及其它自分泌或旁分泌介质的 加工产生更多的促血管生成因子，从而完成正反馈回路（图6e)。
[0133] CD133干细胞在新血管形成和毛囊再生中起重要作用，所述新血管形成和毛囊再 生是完美的皮肤再生必不可少的（Sun等，2011)。此类细胞具有沿内皮谱系进行体外分化的 潜能(Ho Ilemann等，2012)并且已知的是响应于介质（VEGF和SDF-I)迀移至新血管形成部 位。免疫荧光双染色显示许多CD133细胞与CD31共染色（图2b)，所述CD31为早期内皮细胞标 志物。在成熟过程中，⑶133标志物减弱，获得⑶31表型(Ho 11 emann等，2012)。增强的血管生 成与创伤部位增加的浸润CD133+CD31+祖细胞数目相关并加强新血管形成中这些细胞的作 用。
[0134] 表皮和毛囊的干细胞可在创伤之后经历重编程以变成重新住入表皮祖细胞（Ito 等，2005)。谱系分析还显示毛囊可由毛囊干细胞生态位之外的细胞产生，表明在表皮中发 现的细胞可假定毛囊干细胞表型（Ito等，2007)。最近研究报道CD133为在注入免疫缺陷小 鼠之后形成毛囊和表皮的长期重新住入鼠表皮干细胞和CD133 +角质细胞的标志物 (Charruyer等，2012)。从我们的谱系示踪研究中明显的是由双重药物治疗产生的增加数目 的⑶133干细胞促成毛囊再生。
[0135] 总之，我们在此报道将内源性干细胞动员至皮肤创伤的新型治疗策略产生更好且 更快的愈合。定量和定性差异的程度为高度显著的并且大于在正常动物创伤愈合的任何其 它研究中发现的程度。我们的研究未公开这些可塑细胞分化成组织成分的分子机制，如对 于Fgf9(Gay等，2013)或Sept4/ARTS(Fu Chs等，2013)的报道。有趣的发现为当存在丰富的干 细胞时，分化步骤完美地进行，从而产生几乎正常的皮肤。这是证明AMD3100和低剂量的他 克莫司在产生更快愈合并分化成正常皮肤中存在的所有组织的内源干细胞的动员、募集和 保留中存在显著的协同效应的首次报道。这些发现可以容易地应用于临床。
[0136] 内源性干细胞的药理学动员加速患糖尿病的大鼠的皮肤创伤愈合且改善小鼠中 烧伤创面的愈合
[0137] 材料和方法
[0138] 动物。Lewis 大鼠和C57BL/6J小鼠购买自 Jackson Laboratory (Bar Harbor，ME)并 保持在Johns Hopkins医疗机构的无特定病原的设施中。根据NIH指导方针并且在Johns Hopkins大学动物护理委员会批准的方案下护理动物。
[0139] 患糖尿病的大鼠模型。链脲霉素(STZ)为可引起胰腺β-细胞破坏的抗生素，因此其 在实验上被广泛地用作能够诱导胰岛素依赖性糖尿病（IDDM)(也被称为1型糖尿病(TlDM)) 的药剂。人糖尿病的最常见动物模型为链脲霉素（STZ)诱导的患糖尿病的大鼠。链脲霉素 (STZ)诱导的患糖尿病的大鼠模型用于测定皮肤创伤愈合。在STZ注射(50mg/kg，i.p.)之后 2周，所有大鼠（12-16周龄）患有糖尿病（血糖>450mg/dL)。四个切除创伤位于中线任一侧 Icm以及肋缘与髂嵴之间中点的上方和下方lcm。将消毒的一次性活检穿孔器(直径为5mm; Miltex)垂直对齐标记的中心，通过施加压力并且同时扭动穿过皮肤和肉膜。重复相同程 序，从而在每只动物上生成四处创伤。
[0140] 烧伤创面的小鼠模型。将24-30月龄的小鼠使用麻醉机用3 %异氟烷（Baxter Healthcare Co.，迪尔菲尔德，IL，USA)麻醉，刮剃背部并用Nair乳剂(Church&Dwight Co.， 普林斯顿，NJ，USA)脱毛。如先前所报道生成烧伤创面(Arch Surg 2010; 145: 259-266)。简 言之，定制的100g铝棒在l〇〇°C水浴中加热5min。在每只小鼠的背部产生一处直径1.2cm的 烧伤。为保证烧伤一致性，仅棒的重量提供皮肤表面的压力。选择用节拍器测量的4s接触时 间以产生标准化的全皮层烧伤。烧伤为三度，包括皮肤、皮下组织和肉膜的破坏。皮下施用 丁丙诺啡(0.1 mg/kg)用于镇痛。
[0141]治疗和创伤测量。在恢复意识之后，将动物单独饲养，并从第0天至完全闭合当天 皮下注射AMD3100(AMD) (1 · 0mg/kg，每两天，Sigma-Aldrich，St Louis，M0)或/和他克莫司 (T) (0 · lmg/kg，每天，购买自Johns Hopkins医院的药房）。
[0142] 以指定的时间间隔对每个创伤部位数码拍照，并且使用Adobe Photoshop(版本 7.0;Adobe Systems，San Jose，CA)测定照片上的创伤区。将随着时间的推移创伤区的变化 表达为最初创伤区的百分比。所有创伤评价为双盲的。
[0143] 结果
[0144] 实施例6:AMD3100+低剂量的他克莫司加速患糖尿病的大鼠中的皮肤创伤愈合。在 未患糖尿病的大鼠的对照组手术之后18天，创伤达到完全闭合，这与该建立模型中已知的 愈合动力学相一致。然而，在用盐水治疗的患糖尿病的大鼠中愈合显著延迟，在手术后第23 天创伤达到完全闭合。与盐水对照组相比，单独用他克莫司或AMD3100治疗的动物(n = 4或 5)显示出明显地但仅稍微更快的治愈，创伤在第21天达到完全闭合。在用AMD3100+低剂量 的他克莫司治疗的患糖尿病的大鼠中，愈合时间减少至18天或减少22%。数码图像显示双 重药物疗法的治疗在刚第7天便对降低皮肤缺陷的大小具有显著效果(图11)。
[0145] 实施例7: AMD3100+低剂量的他克莫司改善小鼠中烧伤创面的愈合。在不同时间点 通过测量创伤区分析皮肤病损。在对照（盐水)组(n = 7,5只C57BL/6J+2只129Sl/SvImJ小 鼠）中，在烧伤之后26天创伤达到完全闭合。与盐水对照组相比，单独用他克莫司或AMD3100 治疗的动物显示出显著加速创伤闭合，创伤分别在第21天和第23天达到完全闭合。有趣地 是，用AMD3100+低剂量的他克莫司治疗的小鼠的创伤区的减少甚至更有效，已经从第13天 开始。在第17天，在该组合治疗组中的所有创伤被上皮覆盖，并且被认为是闭合的，证明组 合疗法对烧伤创面愈合具有显著效果（图12)。双重药物治疗也在烧伤后2个月显著减少瘢 痕形成（图13)。
[0146]
[0147] 总之，我们证实创伤愈合方面确实适用于患糖尿病的大鼠和小鼠烧伤模型。结果 显示内源性干细胞的药理学动员加速患糖尿病的大鼠的皮肤创伤愈合(愈合时间减少至18 天(从23天)或减少22%)并且改善小鼠的烧伤创面的愈合(治愈时间减少至17天(从26天） 或减少34% )。我们相信在我们的研究中发现的原理在组织修复和再生中具有重要意义。
【主权项】
1. 一种用于改善患者的创伤愈合的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的干细胞动 员剂和免疫抑制剂。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞动员剂选自由六1?)3100、410)3465、丁6-00 54、BKT140、G-CSF、GM-CSF、SDF-1 和 SCF构成的组。3. 如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞动员剂为CXCR4拮抗剂。4. 如权利要求3所述的方法，其中所述干细胞动员剂为AMD3100。5. 如权利要求1所述的方法，其中所述免疫抑制剂选自由他克莫司、环孢菌素、莫罗单 抗-CD3、麦考酚酯和西罗莫司构成的组。6. 如权利要求5所述的方法，其中所述免疫抑制剂为他克莫司。7. 如权利要求1所述的方法，其中所述免疫抑制剂以低剂量施用。8. 如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞动员剂和所述免疫抑制剂为相同的化合 物。9. 一种用于改善患者的创伤愈合的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的干细胞动 员剂和低剂量的免疫抑制剂。10. -种用于改善患者的创伤愈合的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的AMD3100 和低剂量的他克莫司。11. 如权利要求10所述的方法，其中所述低剂量的他克莫司为约〇.〇lmg/kg至约 0·05mg/kg。12. -种用于改善患者的创伤愈合的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的药剂和 低剂量的免疫抑制剂，所述药剂动员CD34+干细胞和/或CD133+干细胞。13. 如权利要求12所述的方法，其中动员CD34+干细胞和/或CD133+干细胞的所述药剂为 AMD3100并且所述免疫抑制剂为他克莫司。14. 一种用于改善患者的创伤愈合的方法，包括以足以将干细胞动员至接受者的外周 血的量向所述患者施用低剂量的他克莫司。15. 如权利要求14所述的方法，其中所述低剂量的他克莫司为约0.01mg/kg至约 0·05mg/kg。16. 如权利要求14所述的方法，其中所述低剂量的他克莫司产生约0. lng/ml至约10ng/ ml的血液浓度范围。17. 如权利要求14所述的方法，其中所述低剂量的他克莫司为约0.01mg/kg至约 0·05mg/kg。18. 如权利要求14所述的方法，还包括施用第二药剂以将干细胞动员至所述外周血。19. 如权利要求18所述的方法，其中所述干细胞动员剂选自由六1?)3100、41?)3465、丁6-00 54、BKT 140、G-CSF、GM-CSF、SDF-1 和 SCF构成的组。20. 如权利要求18所述的方法，其中所述干细胞动员剂为CXCR4拮抗剂。21. 如权利要求18所述的方法，其中所述干细胞动员剂为AMD3100。22. -种用于改善患者的创伤愈合的方法，包括以足以将⑶34+干细胞和/或⑶133+干细 胞动员至外周血的量向所述患者施用低剂量的他克莫司。23. 如权利要求22所述的方法，其中所述低剂量的他克莫司为约0.01mg/kg至约 0·05mg/kg。24. -种用于改善患者的创伤愈合的方法，包括以约0.0 lmg/kg至约0.5mg/kg的剂量向 所述患者施用他克莫司，其中所述剂量范围足以将CD34+干细胞和/或CD133+干细胞动员至 外周血。 2 5. -种用于改善患者的创伤愈合的方法，包括以约0.01 mg/kg至约0.0 7 5mg/kg的剂量 向所述患者施用他克莫司，其中所述剂量范围足以将CD34+干细胞和/或CD133+干细胞动员 动员至外周血。26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述患者为糖尿病患者或者遭受烧伤。
【专利摘要】本发明涉及创伤愈合领域。更具体地，本发明提供了可用于经由自体干细胞动员改善创伤愈合的方法和组合物。在一个实施方式中，用于改善患者的创伤愈合的方法包括向所述患者施用治疗有效量的干细胞动员剂和低剂量的免疫抑制剂。
【IPC分类】A61K31/4433, A61K31/395, A61P17/02, A61K38/19, A61P17/00
【公开号】CN105658217
【申请号】
【发明人】孙兆黎, 乔治·梅尔维尔·威廉姆斯, 青·林
【申请人】约翰霍普金斯大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年4月29日