33谱系示踪小鼠的生成 的文章(Nature 2009;457:603-607!Genesis 2007;45:593-605)定义他莫昔芬的剂量和时 间。在指定时间点通过CO2安乐死术处死动物，将包括创伤区及创伤区周围的皮肤样本切 除，固定在2%多聚甲醛中于4°C过夜，在30%蔗糖中于4°C冷冻保护过夜并在OCT(最佳切割 温度)冷冻。使用Leica低温恒温器获得冷冻的切片并在PBS中洗涤载玻片5min。用商用的β-半乳糖苷酶染色试剂盒(BioVision Inc .MiIpitas，CA)利用X-gal作为底物进行IacZ分析。 在用70%甘油封固之后，在Zeiss显微镜下观察蓝色显影的切片。对于GFP显微术，将皮肤切 片用含有DAPI的封固介质(Vector Laboratories Inc.，伯林盖姆，CA)覆盖并用共焦焚光 显微术(Carl Zeiss Microscopy，索恩伍德，NY)成像。为鉴别IacZ-和GFP-阳性组织和细胞 的结构，根据制造商的说明，将相同切片相继用针对GFP荧光研究的DAPI染色，随后用X-gal 及苏木精和伊红(H&E)染色（IHC World，伍德斯托克，MD)。
[0112] 毛囊的定量分析:再生毛囊的数目以双盲方式定量。在未受伤的皮肤中，在来自与 创伤相同位置的区域中的毛囊数目进行计数，并将该毛囊数目与实验组进行比较（图2A和 图9A;虚线指示创伤边缘）Jasson三色法（来自PoIysciences，Inc .Warrington，PA的商业 试剂盒)用于检测胶原纤维(蓝色）。
[0113] 免疫荧光染色:对于免疫荧光染色，将冷冻的切片用丙酮(-20°C)固定IOmin并在 室温下干燥lh。将含有1%BSA和5%标准驴血清的PBS用于阻断非特异性背景。将切片用第 一抗体在室温孵育1.5h，第一抗体包括:对⑶133特异的兔多克隆抗体（1:100，abl9898， Abeam，坎布里奇，MA)、对c_K it特异的兔多克隆抗体（1 : 100, sc-168，Santa Cruz Biotechnology，圣克鲁兹，CA)、对CD34特异的山羊多克隆抗体（I : 100, AF4117, R&D Systems，明尼阿波利斯，MN)、对SDF-I特异的小鼠单克隆抗体（1:100，MAB310，R&D Systems )、对 F4/80 特异的 FITC-偶联的大鼠单克隆抗体（1:100，11-4801，eBioscience，圣 地亚哥，CA)、对α-SMA特异的小鼠单克隆抗体（1:100，ab7817，Abeam)、对CD31特异的大鼠单 克隆抗体（1:100，14-0311，eBioscience)或对HGF特异的兔多克隆抗体（1:100，sc-7949,圣 克鲁兹）或者它们中的两个针对双荧光染色的组合。在用PBS漂洗之后，将切片用以下的第 二抗体在室温再fP?育 lh: Cy3驴抗-兔IgG( 1: 200，711-166-152，Jackson ImmunoResearch， West Grove，PA)、Cy3驴抗-山羊IgG( 1:200，705-166-147，Jackson ImmunoResearch)、Cy3 驴抗-小鼠 IgG( 1: 200,715-615-151 ,Jackson ImmunoRe search)、FITC驴抗-小鼠 IgG( I: 200，715-096-150 Jackson ImmunoResearch)或FITC驴抗-大鼠 IgG( 1:200，712-097-003， Jackson ImmunoResearch)或者它们中具有不同颜色的两种(Cy3和FITC)针对双荧光染色 的组合。用DAPI将细胞核染成蓝色。通过共聚焦显微镜(Carl Zeiss显微术，索恩伍德，NY) 分析组织切片。
[0114] 流式细胞术。在通过心脏内穿刺处死之前取出外周血。用红血细胞裂解缓冲液 Hybr i -Max?( s i gma)裂解红细胞。洗涤残余的细胞并分析悬浮液(IX 106)的谱系阴性c-K i t +、CD34+和⑶133+干细胞标志物的表达。使用的所有抗体来自商业来源，第一抗体包括： CD133(l:100，abl9898，Abeam)、CD34(l:100，AF4117，R&DSystems)、c-Kit(l:100，14-1171，613；[08(^61106)、小鼠造血谱系组(口31161)(613；[08(^61106)包括的生物素-偶联的0)3(1: 100，13-0031)、CD45R/B220(1:100，13-0452)、CDllb(1:100,13-0112)、TER-119(1:200,13-5921)和Ly-6G( 1:200，13-5931);第二抗体包括：FITC抗大鼠 IgG(l :200，712-096-150， Jackson ImmunoResearch)、PE抗兔IgG( 1:200，12-4739，eBioscience)、APC抗山羊IgG( 1: 200,705-136-147 ,Jackson ImmunoResearch)和链霉亲和素-PerCP(l :200，554064，BD Pharmingen)。将非特异性抗体结合用标准驴血清(Sigma)阻断30min。将细胞用第一抗体在 4 °C孵育30min，随后用第二抗体在4°C孵育30min，并使用CELLQuest软件（Becton-Dickinson，贝德福德，MA)通过流式细胞术对阳性细胞进行计数（荧光激活细胞分选术 [FACS])。
[0115] 半定量逆转录聚合酶链式反应分析。将皮肤样本在_80°C保持冷冻直至使用 TRIzol试剂（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA，USA)勾质化用于RNA提取。然后，根据制造商的说 明，使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR; Invitrogen)的superscript第一链合成系统进行 5yg总RNA的第一链cDNA的合成。在50yL反应溶液中，PCR含有IyL脱氧核苷三磷酸混合物(每 种 dNTP 为 10mM)、lyL 10μΜ 的每种引物、〇.4yL(5IUyL -MPlatinum Taq 聚合酶 (Invitrogen)、I · 5yL 50mM MgCh和2yL总DNA作为模板。热循环开始为：94°C，保持4min，一 个循环。随后为94°C，保持30s ; 59°C保持30s ; 72°C保持30s ; 25-35个循环，以及72°C保持 IOmin用于最终延伸。将PCR产物在1.2 %琼脂糖凝胶上进行电泳移动，用GelSmr?染色 (Lonza Rockland Inc ·，Rockland，ME)可视化。对于小鼠样品，使用了下述引物：SDF-1 (GenBank登录号NM_021704 · 3): 5 '-GACGGTAAACCAGTCAGCCT-3 '（正向）（SEQ ID NO: 1)和5 '-CACACTTGTCTGTTGTTGTTCTTC-3 '（反向）（SEQ ID NO: 2) ;CD133(NM_008935 · 2) : 5 TCCAGCAAACAAGCAACAAG-3 '（正向）（SEQ ID NO: 3)和5 '-CCTATGCCGAACCAGAACA-3 '（反向） (SEQ ID N0:4);VEGF(NM_001025250.3):5'-CACTGGACCCTGGCTTTACT-3'（正向）（SEQ ID NO: 5)和5 ' -GGTGATGTTGCTCTCTGACG-3 '（反向）（SEQ ID NO: 6); b-FGF(NM_008006 · 2): 5 ' -CAAGGGAGTGTGTGCCAA-3 '（正向）（SEQ ID NO: 7)和5 ' -TGCCCAGTTCGTTTCAGT-3 '（反向）（SEQ ID N0:8);HGF(NM_010427.4):5'-ATGAGAGAGGCGAGGAGAAG-3'（正向）（SEQ ID N0:9)和5'-GTAGCCCCAGCCGTAAATA-3'（反向）（SEQ ID NO: 10) ;β-肌动蛋白（ΝΜ_007393·3) :5'_ TGGCACCACACCTTCTACAAT-3 '（正向）（SEQ ID NO: 11)和5 ' -ACCAGAGGCATACAGGGACA-3 '（反 向）（SEQ ID NO: 12)。靶标mRNA的表达水平通过光密度法定量并用对应的内控标准化。
[0116] 统计。连续变量呈现为平均值土 SEM。两分法变量呈现为数值和百分比值。使用针 对所有分析呈现的初步数据集进行功效分析以确定进行足够的统计功效必需的样本大小。 对于所有动物研究，将小鼠和大鼠随机分配给治疗组。创伤闭合和毛囊再生的分析以盲式 进行。预先制定对于动物研究或样本分析的所有入选/排除标准。使用学生t检验(双尾)分 析流式细胞术、RT-PCR和新生毛囊计数的数据，通过Fi sher精确检验(双尾)分析两分法变 量。Newman-Keul s检验的单向ANOVA用于群组之间皮肤创伤闭合的动力学分析。对于每个 图，基于数据的群体分布和比较数目（个体或多个)选择适当的统计检验。所有数据满足使 用的统计检验的假设。在每组数据内存在方差的估算。群组之间的方差是相似的。使用 SPSS ? (SPSS，芝加哥，IL，USA)进行所有分析。p〈0.05被认为是显著的。
[0117] 结果
[0118] 实施例1:在全皮层皮肤切除之后AMD3100+低剂量的他克莫司加速创伤愈合。在野 生型C57/B6小鼠的刮剃背部通过5mm直径的圆形切除产生四个全皮层创伤（图1A)。以指定 的时间间隔对每个创伤部位数码拍照，并且使用Adobe Photoshop软件计算创伤区。将随着 时间的推移创伤区的变化表达为最初创伤区的百分比（图lb)。将受伤小鼠随机分成四个实 验组并在创伤之后立即接受盐水或药物的皮下注射直至完全治愈：1)对照组，用盐水处理， 2)他克莫司组，每天用低剂量(0· Img kg<)处理，3)AMD3100组，每隔一天处理（1 ·Omg kg一〇 以及4)组合组，给予低剂量的他克莫司和AMD3100。全部创伤评价为双盲的。
[0119] 在第1组(n = 6)中，在手术之后第12天创伤达到完全闭合（图Ic和图Id)，这与在该 建立的模型中已知的愈合动力学相一致(Shinozaki等，2009;Mack等，2012)。与盐水对照组 相比，单独用他克莫司或AMD3100治疗的6只动物显示出显著地但仅适度较快的愈合（图 Id)，因为在第11天创伤达到完全闭合。在用AMD3100+低剂量的他克莫司治疗的第4组小鼠 中，治愈时间减少至九天或减少25%。数码图像显示用双重药物疗法治疗在第5天时具有立 即降低皮肤缺陷大小的显著作用（图Id)，第5天为创伤愈合的再上皮化阶段的开始。肉眼可 见地，在双重药物治疗组中在创伤后第5天在皮肤边缘处观察到极小的溃疡和早期上皮内 向生长，而在其它三组中的创伤很少显示（如果有的话)任何上皮化以及继续溃疡（图Ic和 图lh)。我们在大鼠中重复这些研究并且发现接受双重药物疗法的大鼠也具有将完全愈合 的时间从18天显著减少至13天或减少28 %的等同效果（图7)。
[0120]小鼠皮肤是易变的，并且收缩占创伤闭合的大部分。为阻止该机制，我们进行了切 除创伤夹板疗法模型，其中夹板固定环紧紧地固定创伤周围的皮肤(图le)。因此，创伤通过 肉芽形成和再上皮化愈合，该过程类似于大多数人类皮肤缺陷的治愈。我们发现：与对照 (盐水)组相比，在用低剂量的他克莫司或AMD3100单一疗法治疗的夹板固定的创伤中创伤 修复加速，同时在接受双重治疗的动物中发现最为加速的愈合（图If和图Ig)。因此， AMD3100+低剂量的他克莫司的治疗效果主要为皮肤创伤上皮化。将其它组的小鼠用高剂量 的AMD3100(5.0mg kg<)或他克莫司（l.Omg kg<)治疗，并且我们发现高剂量的他克莫司阻 碍皮肤创伤愈合，然而增加AMD3100的剂量未显示出显著差异（图8)。
[0121] 实施例2:AMD3100+低剂量的他克莫司改善瘢痕形成并促进毛囊再生。皮肤创伤修 复开始于出血停止，随后出现炎症应答、在创伤空间内形成肉芽组织、创伤的纤维化以及再 上皮化，最后产生瘢痕。
[0122] 在组织学上，第15天时对照组中的再上皮化创伤显示出无组织的表皮，表皮与真 皮之间的边界模糊（图2b)。在第1组、第2组和第3组小鼠中存在很少的毛囊，并且胶原为丰 富的且无组织的（图2c)，这与公布的研究结果相一致(Devine等，2004)。相比之下，双重药 物治疗的动物具有含有结构良好的毛囊的薄且组织有序的表皮以及更佳组织化的胶原（图 2b和图2c;下图）。最惊人的发现为:在15天之后，仅在双重药物治疗的动物的再上皮化创伤 中出现毛囊（图2a和2d)。不令人惊讶的是，与对照组相比，在双重药物治疗的动物中，再上 皮化创伤的组织切片中毛囊的数目显著较高（图2e)。我们发现双重药物治疗还刺激大鼠中 毛囊再生并降低瘢痕形成（图9)。因此，低剂量的他克莫司和AMD3100的组合通过促进再上 皮化和皮肤组分的分化来改善创伤愈合。
[0123] 实施例3:AMD3100和低剂量的他克莫司协同动员谱系阴性（Lin-)c-Kit+CD34+ CD133+干细胞，然而低剂量的他克莫司增加产生SDF-I的巨噬细胞的数目。我们对血液样品 进行流式细胞术以测定通过用普乐沙福和他克莫司治疗而动员的干细胞组分。Lin-c-Kit、 Lin-CD34+、Lin-CD133+细胞和Lin-三个一组阳性(c-Kit+CD34+CD133+)细胞的数目在损伤 后5天于接受组合药物治疗的动物的外周血中显著较高（图3a)。创伤组织切片的免疫荧光 染色显示：如c-Kit+和⑶34+细胞，⑶133+的数目通过组合治疗增加（图3b)。在创伤的新形 成的肉芽组织中特别发现了这些细胞。有趣地是，在第5天时间点时，许多CD 133+细胞与 ⑶31共染色，⑶31为内皮细胞的标志物（图3b;右图）。
[0124] 肉芽组织的半定量PCR分析显示:与第1组、第2组和第3组相比，在创伤之后5天，吸 引子分子、间质细胞来源的因子(SDF)-I和干细胞标志物CD133的mRNA表达在第4组中显著 增加（图4a和图4b)。免疫荧光染色显示SDF-I和F4/80(巨噬细胞的标志物）阳性细胞的数目 在损伤后5天在仅接受低剂量的他克莫司或用双重药物治疗的动物的创伤部位中显著较高 (图4c)。有趣地是，SDF-I与一些F4/80+细胞共染色，这表明这些巨噬细胞产生或呈递SDF-I (图4c;下图）。
[0125] 实施例4:双重药物治疗在创伤后五天增加血管生成细胞因子的表达。肉芽组织的 半定量PCR分析显示：与第1组、第2组和第3组相比，血管生成细胞因子、血管内皮生长因子 (VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、重要的干细胞动员和归位因子、肝细胞生长因 子(HGF)的mRNA表达在第4组中显著增加（图5a和图5b)。免疫荧光染色显示HGF阳性细胞的 数目在损伤后5天从第4组小鼠恢复的肉芽组织中显著增加。类似地，与第1组、第2组和第3 组相比，肉芽组织中⑶31+内皮细胞的数目在第4组小鼠中显著增加。这些⑶31+细胞中的一 些在肉芽组织中形成管状结构（图5c;右图），其也对HGF进行染色，从而强调了 HGF在新血管 形成中的重要作用。管状结构还与CD133共染色（图3b;右图），这表明HGF可能参与来自 CDl 33前体的内皮细胞的分化。
[0126] 我们寻求增强产生促进基质的细胞的证据，事实上，免疫荧光染色显示：与第1组 相比，α-平滑肌肌动蛋白（SMA)阳性成肌纤维细胞的数目在从第2组和第3组小鼠中恢复的 肉芽组织中增加，而第4组小鼠在第5天在肉芽组织中明显地募集更多的成肌纤维细胞（图 5c;下图）。
[0127] 实施例5:谱系示踪显示通过将AMD3