经由自体干细胞动员的创伤愈合的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年11月22日提交的美国临时申请第61/907,624号以及于2013 年4月29日提交的美国临时申请第61 /816，827号的权益，所述美国临时申请中的每一个通 过引用整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及创伤愈合领域。更具体地，本发明提供了可用于经由自体干细胞动员 改善创伤愈合的方法和组合物。
[0004] 以电子方式提交的材料通过引用并入
[0005] 本申请包含序列表。序列表已经以标题为"P12415-03_ST25.txt"的ASCII文本文 件经由EFS-Web以电子方式提交。序列表的大小为2,713字节，并且创建于2014年4月24日。 据此通过引用整体并入。
【背景技术】
[0006] 在美国每年有多于125万人遭受烧伤以及650万人具有由压力、静脉淤滞或糖尿病 引起的慢性皮肤溃疡(Singer and Clark，1999)。这些病况的治疗仍不完善并且费用昂贵。 希望干细胞疗法可以证明是有益的，因为已经越来越明确确定的是干细胞在创伤愈合中起 着重要作用。例如，已经显示，人工皮肤替代物在将干细胞掺入这些膜时更有效。烧伤愈合 的质量得到改善(Leonardi等，2012)，减少了瘢痕形成并且重建皮肤附属器(Mansilla等， 2010 ;Tamai等，2011 ;Huang和BurcU 2012)。慢性静态糖尿病溃疡的治疗已经通过将患者的 骨髓(BM)间充质干细胞(MSC)与埋入可生物降解的胶原膜(ColadermR)的自体皮肤成纤维 细胞组合使用而得到改善(Vojtassak等，2006)。已经显示来自胚胎来源和出生后来源的BM 细胞修复胶原合成中的遗传缺陷和基膜缺陷，从而促进皮肤创伤愈合（Chino等，2008 ; Tolar等，2009 ;Fujita等，2010)。最近，临床试验发现在患有由缺乏Col 7引起的发疱皮肤 病症的人中的同种异体的全BM移植致使皮肤完整性恢复以及Col 7在基膜中表达(Wagner 等，2010)。
[0007]许多基础的细胞研究也已经强调皮肤与BM之间的可塑关系。在具有造血谱系和间 充质谱系的真皮中的成纤维细胞样细胞来源于BM，并且这些细胞的数目在皮肤创伤之后增 加(Fathke等，2004; Ishii等，2005)。在BM移植之后，供体细胞已经替换一些角化细胞并且 已经在表皮中存留至少3年(Korbling等，2002) AM细胞有助于胎儿皮肤形成，因为将绿色 荧光蛋白（GFP)BM细胞输注入小鼠的子宫中导致GFP-阳性细胞在形成的皮肤中积聚，所述 皮肤特别是与形成毛囊相关的(Chino等，2008)。
[0008]这些大量的研究记录BM干细胞在创伤愈合中的重要性并且提出了令人向往的可 能性:可利用细胞过程制定实用的治疗方案来治疗需要立即治疗的大量全皮层烧伤和大量 软组织损伤。通过利用干细胞改善创伤修复的可能性使用NIH登记簿列出的基于MSC的疗法 通过存在的90个临床试验得以证实(Cerque ira等，2012)。
[0009] 为避免价格昂贵且耗时的内源干细胞的制备，我们计划在这些研究中将内源干细 胞与AMD3100和他克莫司（Tacrolimus)药理动员。已经显示AMD3100能在动物和人中将来自 BM的内源干细胞驱向血流。低剂量的他克莫司证明具有协同效应，组合治疗有希望成为将 干细胞呈递至损害区域的简单、安全且迅速的方法。在此，我们在小鼠和大鼠中治愈全皮层 皮肤创伤来检验这一假设。发现该治疗能够将完全愈合的时间减少25%，我们描绘了创伤 中干细胞/祖细胞和相关细胞因子/生长因子的特性并且使用谱系示踪证实动员的CD133+ 干细胞在创伤区的血管生成和毛囊再生中的重要作用。
【发明内容】
[0010] 本发明至少部分基于这样的发现:干细胞动员剂和免疫抑制剂可被用于促进或改 善患者中的创伤愈合。事实上，如本发明的实施方案中所述的内源性干细胞的药理学扩增 是吸引人的，因为它提供了向损伤区呈递干细胞的简单、迅速的方法。
[0011] 如本文所述，本发明人假设:用AMD3100(即普乐沙福(plerixafor))与低剂量的他 克莫司组合动员骨髓干细胞将在一些实施方式中促进再上皮化以及在进一步实施方式中 促进毛囊的再生，从而产生较迅速的正常皮肤的恢复。为检验该假设，我们首先检查普乐沙 福、他克莫司或双重药物对全皮层皮肤切除的小鼠模型中的创伤愈合的效果。第二，我们描 述了创伤区中干细胞/祖细胞和相关的细胞因子/生长因子的特征。最后，我们通过使用谱 系示踪来评估动员的CD133+干细胞对创伤区的血管生成和毛囊再生的贡献。
[0012] 更具体地，在特定实施方式中，低剂量而非高剂量的他克莫司(FK-506)经由将产 生SDF-I的巨噬细胞募集至创伤区来改善创伤愈合。另外，用普乐沙福与低剂量的他克莫司 组合动员骨髓干细胞加速创伤愈合、促进再上皮化以及促进毛囊再生。事实上，低剂量的他 克莫司与普乐沙福的组合通过促进皮肤组分的再上皮化和分化来改善创伤愈合。
[0013]因此，在一方面，本发明提供了可用于改善患者的创伤愈合的方法和组合物。在一 个实施方式中，用于改善患者的创伤愈合的方法包括向患者施用治疗有效量的干细胞动员 剂和免疫抑制剂。在一些实施方式中，干细胞动员剂选自由AMD3100、AMD3465、TG-0054、 8〇140、6-03?、61-03?、30?-1和30?构成的组。在【具体实施方式】中，干细胞动员剂为0乂〇?4拮 抗剂。在更具体的实施方式中，干细胞动员剂为AMD3100。在其它实施方式中，免疫抑制剂选 自由他克莫司、环孢菌素、莫罗单抗-CD3(0rth 〇Cl〇ne 0KT3)、麦考酚酯和西罗莫司构成的 组。在【具体实施方式】中，免疫抑制剂为他克莫司。在特定实施方式中，以低剂量施用免疫抑 制剂。在某些实施方式中，干细胞动员剂和免疫抑制剂为相同化合物。
[0014] 在另一实施方式中，改善患者的创伤愈合的方法包括向患者施用治疗有效量的干 细胞动员剂和低剂量的免疫抑制剂。在更具体的实施方式中，改善患者的创伤愈合的方法 包括向患者施用治疗有效量的AMD3100和低剂量的他克莫司。在甚至更具体的实施方式中， 低剂量的他克莫司为约〇. 〇lmg/kg至约0.05mg/kg。
[0015] 本发明还提供改善患者的创伤愈合的方法，其包括向患者施用治疗有效量的药剂 (agent)和低剂量的免疫抑制剂，所述药剂动员CD34+和/或CD133+干细胞。在某些实施方式 中，动员⑶34+和/或⑶133+干细胞的药剂为AMD3100并且免疫抑制剂为他克莫司。
[0016] 在另一方面，药剂充当干细胞动员剂和免疫抑制剂两者。在一个实施方式中，改善 患者的创伤愈合的方法包括以足以将干细胞动员至接受者的外周血的量向患者施用低剂 量的他克莫司。在【具体实施方式】中，低剂量的他克莫司为约O.Olmg/kg至约0.05mg/kg。在另 一实施方式中，低剂量的他克莫司导致约〇. lng/ml至约10ng/ml的血液浓度范围。在更具体 的实施方式中，低剂量的他克莫司为约〇.〇lmg/kg至约0.05mg/kg。在另一实施方式中，低剂 量包括约O.lyg/kg至I mg/kg。
[0017] 在某些实施方式中，所述方法还包括施用第二药剂以将干细胞动员至外周血。在 一个实施方式中，干细胞动员剂选自由 AMD3100、AMD3465、TG-0054、BKT140、G-CSF、GM-CSF、 SDF-I和SCF构成的组。在【具体实施方式】中，干细胞动员剂为CXCR4拮抗剂。在更具体的实施 方式中，干细胞动员剂为AMD3100。
[0018] 本发明还提供改善患者的创伤愈合的方法，其包括以足以将⑶34+和/或⑶133+干 细胞动员至外周血的量向患者施用低剂量的他克莫司。在【具体实施方式】中，低剂量的他克 莫司为约0.05mg/kg至约0.5mg/kg(在嗤齿动物中，所述量可由本领域普通技术人员转化成 人类剂量）。
[00?9]在另一实施方式中，改善患者的创伤愈合的方法包括以约0.01mg/kg/天至约 0.05mg/kg/天的剂量向患者施用他克莫司，其中所述剂量范围足以将⑶34+和/或⑶133+干 细胞动员至外周血。在另一实施方式中，改善患者的创伤愈合的方法包括以约〇.〇lmg/kg至 约0.075mg/kg的剂量向患者施用他克莫司，其中所述剂量范围足以将⑶34+和/或⑶133+干 细胞动员至外周血。在特定实施方式中，患者为糖尿病患者或者遭受烧伤。
[0020]在某些实施方式中，低剂量的他克莫司导致约0. lng/ml至约10ng/ml的血液浓度。 在其它实施方式中，可施用低于约〇.〇75mg/kg/天（口服)或低于约0.01mg/kg/天（IV)的任 何量。
[0021]用于免疫抑制的他克莫司的正常剂量为约0. lmg/kg/天至0.3mg/kg/天（口服）以 及约0.01mg/kg/天至0.05mg/kg/天（IV)。在某些实施方式中，他克莫司的低剂量为约正常 剂量的1/10，例如约〇 · 〇lmg/kg/天至0 · 03mg/kg/天（口服）以及约0 · 001mg/kg/天至 0·005mg/kg/天（IV)。
[0022] 本发明提供了在用于改善对象中创伤愈合的方法中使用的干细胞动员剂和免疫 抑制剂，其中干细胞动员剂和免疫抑制剂以治疗有效量施用于对象，并且其中以本文所述 的低剂量施用免疫抑制剂。动员CD34+和/或CD133+干细胞的药剂以及低剂量的免疫抑制剂 用于治疗器官移植接受者的方法中，其中所述干细胞动员剂和所述免疫抑制剂以治疗有效 量施用于接受者。干细胞动员剂和免疫抑制剂，其中动员CD34+和/或CD133+干细胞的药剂为 AMD3100并且免疫抑制剂为他克莫司。根据此处所述的任一实施方式中所使用的干细胞动 员剂和免疫抑制剂，其中所述干细胞动员剂和所述免疫抑制剂为相同化合物。
【附图说明】
[0023] 图1示出用低剂量的他克莫司和AMD3100组合治疗的小鼠中加速的创伤愈合。（a) 模型:在第〇天，在C57BL/6或CD133+/C-L小鼠中创建四个圆形切除创伤。(b)创伤测量。使用 Adobe Photoshop软件测定创伤区域。（c)早期愈合。小鼠(n = 6)中代表性的创伤照片在第5 天开始显示出显著差异。（d)小鼠（n = 6)中创伤闭合的定量分析。吨〈0.05。（幻在第5天时创 伤的H&E显微照片。比例尺:200μηι。（;〇用夹板固定的（splinted)创伤模型。（g)在用夹板固 定的小鼠中皮肤创伤愈合的肉眼可见分析。（h)在用夹板固定的小鼠（η = 6)中创伤闭合的 定量分析。*P〈〇.〇5。所有数据表示平均值±SEM。
[0024] 图2示出在用双重药物疗法治疗的小鼠的愈合皮肤中毛囊再生增加以及瘢痕形成 减少。（a)再上皮化创伤的代表性肉眼可见的外观(第15天）。卬)来自瘢痕中部的代表性显 微镜可见的H&E-染色切片显示愈合创伤内新的毛囊。瘢痕区通过虚线描画出轮廓。两条竖 直的点线有助于区别具有与在盐水处理组中愈合的瘢痕区的长度相同的区域。比例尺:200 Wiu(C)用Masson三色法染色的相邻切片。（d)在创伤后15天双重药物治疗的动物的代表性 照片显示出在再上皮化创伤中毛发生长。（e)在愈合的瘢痕内（2mm)毛囊的定量。数据表示 平均值土 SEMb = ^。*?^ .01。
[0025] 图3示出用双重药物疗法募集BM干细胞。（a)在损伤之后第5天通过流式细胞术定 量分析外周血中的谱系阴性(Lin-)c-Kit+、⑶34+和⑶133+细胞。数据表示平均值土SEM(n =3)。*?〈0.05。（13)在损伤之后第5天对来自受伤小鼠的组织切片中的干细胞标志物(3-1(^、 CD34和CD133以及内皮细胞标志物CD31进行免疫荧光染色。框区显示在较高放大倍数下，接 受双重药物治疗的小鼠具有管状排列的CD133细胞，其与CD31共染色。细胞核被DAPI染成蓝 色。代表性照片为每组η = 3的个体受损皮肤样本。epi，表皮;we，创伤边缘。比例尺:200μηι。 [0026]图4示出SDF-I和⑶133在用双重药物疗法治疗的小鼠的皮肤创伤中的表达增加。 在损伤后5天对受伤皮肤中的肉芽组织进行半定量RT-PCR分析。（a)吸引子分子SDF-I的 mRNA表达在低剂量的他克莫司治疗组中显著增加，并在双重治疗组中进一步升高。（b)干细 胞标志物⑶133mRNA水平在双重治疗组的创伤中也显著较高，所述水平平行SDF-I基因表 达。所有数据表示平均值土 SEM(n = 3)。*p〈0.05。（c)在损伤之后5天对SDF-l和F4/80(巨噬 细胞的标志物)进行双重免疫荧光染色。epi，表皮;we，创伤边缘。比例尺:200μπι。
[0027] 图5示出用双重药物疗法治疗的受伤小鼠中促血管生成因子表达增加。（a)肉芽组 织的半定量PCR分析(第5天）显示VEGF、bFGF和HGF的mRNA上调。（b)通过计算生长因子与β-肌动蛋白比率来确定mRNA表达增加的图示。值表示平均值土SEM(Ii = S)t^pW.05。（c)双重 荧光染色显示:在肉芽组织(第5天）中，大部分表达HGF的细胞与内皮标志物⑶31共染色，并 且这些细胞在双重治疗组中的丰度更高。较下行中的图为对于α-SMA的染色并且显示这些 产生基质的细胞的丰度，平行于⑶31的发现。Epi，表皮;we，创伤边缘。比例尺:200μπι。
[0028] 图6示出⑶133+干细胞在双重治疗组的⑶133+/C-L小鼠中生成毛囊和上皮。（a)分 析在CDl 33-谱系中他莫昔芬诱导的Cre-依赖性GFP表达的方案。（b)未受损的小鼠皮肤组织 显示毛囊中显著的GFP和CD133(lacZ+)表达。（c)在损伤后第15天CD133+/C-L-Rosa26EGFP 创伤皮肤的相同切片的同时的GFP荧光、β-半乳糖苷酶（IacZ)和H&E染色。（d)较高倍 (higher power)显微照片。在框区中，箭头表示在GFP+(左图）、IacZ+(中图）和H&E(右图）染 色的相同切片中的毛囊。箭头指向GFP和IacZ阳性上皮。epi，表皮;we，创伤边缘。比例尺： 200μπι。（ e)在皮肤创伤愈合中组合治疗的治疗机制的图示。
[0029] 图7示出AMD3100与低剂量的他克莫司的治疗提高受伤大鼠中创伤闭合的速度。 (a)全皮层切除创伤的大鼠模型的示例性照片。以指定时间间隔测量5-mm打孔活组织检查 的创伤区直至到达完全闭合。（b)大鼠皮肤创伤愈合的动力学分析。显示出n = 6只动物/组 的代表性图像。（c)显示出在每个时间点相对于最初创伤区的创伤区百分数。数据表示n = 6 只动物/组的平均值土 SEM。*p〈0.05双重治疗的大鼠相对于媒介物治疗的大鼠。
[0030] 图8示出高剂量的他克莫司和AMD3100对小鼠皮肤创伤愈合的影响。（a)皮肤切除 创伤愈合的动力学分析。在指定时间拍照创伤部位。代表性照片是n = 3或4只动物/组的照 片。（b)在每个时间点处与最初创伤区相比创伤区百分比的变化。数据表示n = 3或4只动物/ 组的平均值±SEM。与用盐水处理的小鼠中的创伤闭合相比，定量评价未显示出用他克莫司 (l.Omg kg-Ι)或AMD3100(5.0mg kg-Ι)治疗的小鼠中的创伤闭合的显著差异。
[0031] 图9示出双重药物治疗刺激创伤后大鼠皮肤中的毛囊再生并降低瘢痕形成。全皮 层皮肤切除的大鼠模型如上所述。（a)在创伤后第20天通过H&E(左图和中图）和Masson三色 法(右图）染色评估毛囊再生。显示出每组n = 12个个体皮肤样本的代表性图像:瘢痕用虚线 描画出轮廓，并且箭头指向愈合