0·9、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、 700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或500(^8/1111血清浓度/单 次或多次施用或它们的任何范围、数值或部分。
[0087]作为非限制性实例，对象的治疗可使用单次剂量、输注剂量或重复剂量在1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少之一，或者可选地或另外地，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周中的至少之一，或 者可选地或另外地，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年中的至 少之一，或者它们的任何组合提供一次或定期剂量的本发明的组合物：〇.lng/kg/天至 100mg/kg/天，如0·0001、0·001、0·01、0·1、0·5、0·9、1·0、1·1、1·5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、 80、90 或 I OOmg/kg/天。
[0088]在某些实施方式中，本发明的药物组合物的剂量可任选地包括约0.01mg/kg至约 0.511^/1^的他克莫司，包括但不限于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、 0.1、0.2、0.3、0.4和/或0.511^/1^/施用或它们的任何范围、数值或部分，或者以实现约2.0、 2.5、 2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、 8·9、9·0、9·5、9·9、10、10·5、10·9、11、11·5、11·9、20、12·5、12·9、13·0、13·5、13·9、14·0、 14.5、 4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、 10.9、 11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、 16.9、 17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20ng/ml的血液水平的他克莫司。
[0089] 具体地，可以将本发明的药物组合物在几周的病程内一周施用至少一次。在一个 实施方式中，将药物组合物在几周至几月内一周施用至少一次。在另一实施方式中，将药物 组合物在四周至八周内一周施用一次。在另一实施方式中，将药物组合物在四周内一周施 用一次。
[0090] 更具体地，药物组合物可以如下施用：一天至少一次保持约2天、一天至少一次保 持约3天、一天至少一次保持约4天、一天至少一次保持约5天、一天至少一次保持约6天、一 天至少一次保持约7天、一天至少一次保持约8天、一天至少一次保持约9天、一天至少一次 保持约10天、一天至少一次保持约11天、一天至少一次保持约12天、一天至少一次保持约13 天、一天至少一次保持约14天、一天至少一次保持约15天、一天至少一次保持约16天、一天 至少一次保持约17天、一天至少一次保持约18天、一天至少一次保持约19天、一天至少一次 保持约20天、一天至少一次保持约21天、一天至少一次保持约22天、一天至少一次保持约23 天、一天至少一次保持约24天、一天至少一次保持约25天、一天至少一次保持约26天、一天 至少一次保持约27天、一天至少一次保持约28天、一天至少一次保持约29天、一天至少一次 保持约30天或一天至少一次保持约31天。
[0091 ] 可选地，药物组合物可以如下施用:每1天约一次、每两天约一次、每3天约一次、每 4天约一次、每5天约一次、每6天约一次、每7天约一次、每8天约一次、每9天约一次、每10天 约一次、每11天约一次、每12天约一次、每13天约一次、每14天约一次、每15天约一次、每16 天约一次、每17天约一次、每18天约一次、每19天约一次、每20天约一次、每21天约一次、每 22天约一次、每23天约一次、每24天约一次、每25天约一次、每26天约一次、每27天约一次、 每28天约一次、每29天约一次、每30天约一次或每31天约一次。
[0092] 本发明的药物组合物可替选地可以如下施用：每一周约一次、每两周约一次、每3 周约一次、每4周约一次、每5周约一次、每6周约一次、每7周约一次、每8周约一次、每9周约 一次、每10周约一次、每11周约一次、每12周约一次、每13周约一次、每14周约一次、每15周 约一次、每16周约一次、每17周约一次、每18周约一次、每19周约一次、每20周约一次。
[0093 ]可替选地，本发明的药物组合物可以如下施用:每1个月约一次、每两个月约一次、 每3个月约一次、每4个月约一次、每5个月约一次、每6个月约一次、每7个月约一次、每8个月 约一次、每9个月约一次、每10个月约一次、每11个月约一次或每12个月约一次。
[0094] 可替选地，药物组合物可以如下施用：一周至少一次保持约两周、一周至少一次保 持约3周、一周至少一次保持约4周、一周至少一次保持约5周、一周至少一次保持约6周、一 周至少一次保持约7周、一周至少一次保持约8周、一周至少一次保持约9周、一周至少一次 保持约10周、一周至少一次保持约11周、一周至少一次保持约12周、一周至少一次保持约13 周、一周至少一次保持约14周、一周至少一次保持约15周、一周至少一次保持约16周、一周 至少一次保持约17周、一周至少一次保持约18周、一周至少一次保持约19周或一周至少一 次保持约20周。
[0095] 可替选地，药物组合物可以如下施用：一周至少一次保持约1个月、一周至少一次 保持约两个月、一周至少一次保持约3个月、一周至少一次保持约4个月、一周至少一次保持 约5个月、一周至少一次保持约6个月、一周至少一次保持约7个月、一周至少一次保持约8个 月、一周至少一次保持约9个月、一周至少一次保持约10个月、一周至少一次保持约11个月 或一周至少一次保持约12个月。
[0096] 本发明的药物组合物(例如，干细胞动员剂和/或免疫抑制剂)可通过相同或不同 的施用途径同时或相继施用。药物组合物还可以与一种或多种另外的治疗剂组合。用于本 发明的方法中的药物组合物的特性和量的确定可由本领域普通的医学从业者使用本领域 已知的标准技术容易地进行。在【具体实施方式】中，本发明的干细胞动员剂可以与有效量的 免疫抑制剂组合施用。在其它【具体实施方式】中，干细胞动员剂和免疫抑制剂可以与有效量 的另一干细胞动员剂、另一免疫抑制剂或另一治疗剂组合施用。
[0097] 在多种实施方式中，本发明的干细胞动员剂结合免疫抑制剂（以及任选地另一干 细胞动员剂、另一免疫抑制剂或另一治疗剂)可以如下施用:在大约同时、间隔小于1分钟、 间隔小于2分钟、间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1至约2 小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小 时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间 隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小 时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小 时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小 时至96小时或间隔96小时至120小时。在特定实施方式中，在就诊的相同患者内施用两种或 更多种疗法。
[0098] 在某些实施方式中，组合的本发明的干细胞动员剂结合免疫抑制剂（以及任选地 另一干细胞动员剂、另一免疫抑制剂或另一治疗剂)循环施用。循环疗法涉及施用第一疗法 (例如，干细胞动员剂)保持一段时间，随后施用第二疗法（例如，免疫抑制剂)保持一段时 间，任选地，随后施用可能的第三疗法保持一段时间等，并重复该相继施用，例如，循环，以 便降低对其中一种疗法形成抗性，避免或降低其中一种疗法的副作用和/或改善治疗的功 效。在某些实施方式中，可以重复本发明的组合疗法的施用并且施用可以隔开至少1天、2 天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
[0099]无需进一步详述，据信本领域技术人员使用前面描述，可在最大程度上利用本发 明。下述实施例仅为示例性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。
[0100] 实施例
[0101] 提出下列实施例以便为本领域普通技术人员提供本文所述和要求保护的化合物、 组合物、制品、装置和/或方法如何制得和评价的完整的公开内容和说明，旨在是纯粹示例 性的，并且不旨在限制发明人视为的发明范围。虽然就数字(例如，量、温度等)而言已努力 确保准确，但仍应该对某些误差和差异在此处进行说明。除非另外指出，否则份是重量份， 温度以°(：计或为环境温度，并且压力等于或接近大气压。存在以下反应条件的许多变型和 组合:例如，组分浓度、所需要的溶剂、溶剂混合物、温度、压力以及可以用于优化从所描述 的工艺中获得的产品纯度和产率的其它反应范围和条件。仅需要合理的和常规的实验来优 化这类工艺条件。
[0102] 在全皮层切除之后内源性干细胞的药理学动员显著促进皮肤再生:AMD3100和他 克莫司的协同活性
[0103] 干细胞疗法已经在治疗包括皮肤创伤在内的多种病状中显示出希望，但实际应用 仍难以实现。在此，我们显示由AMD3100和低剂量的他克莫司产生的内源性干细胞动员能够 将完全治愈由手术切除产生的全皮层创伤的时间减少25%。同样重要的是，治愈伴随着瘢 痕形成减少以及毛囊再生。寻找机制中，我们发现与低剂量的他克莫司组合的AMD3100动员 增加数目的谱系-阴性c-Kitf3、CD34l)和CD1331?干细胞。低剂量的他克莫司还增加创伤 部位中含有SDF-I的巨噬细胞的数目，从而增强动员的干细胞至创伤的"拉入"。谱系示踪显 示CD133干细胞在增强毛细血管和毛囊新生起关键作用，有助于更迅速且完美的治愈。我们 的发现提供对于创伤愈合和组织再生的重要治疗方法。
[0104] 材料和方法
[0105] 动物。C57BL/6J小鼠购买自 Jackson Laboratory (Bar Harbor，ME)并且在本研究 中被命名为野生型小鼠。CDl 33+/C-L小鼠（Zhu等，2009)获得自St Jude Children's Research Hospital (Memphis，TN) QmT/mG小鼠由 Steven D · Leach博士友情提供。mT/mG在 Cre切除之前表达细胞膜靶向的tdTomato( "mT"），并且在Cre切除之后表达细胞膜靶向的 EGFP("mG"），从而允许实时可视化和区别重组细胞和非重组细胞(Muzumdar等，2007)。当 mT/mG小鼠与CD133-Cre小鼠杂交时(Zhu等，2009)，mG标记的GFP可通过可诱导的CD133-Cre 转基因系生成（Zhu 等，2009) DDA(RTlAa)大鼠购买自 Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis，I N，USA)。将所有动物保持在Johns Hopkins医疗机构（Johns Hopkins Medical Institutions)的无特定病原的设施中。根据NIH指导方针并且在Johns Hopkins 大学动物护理委员会(Johns Hopkins University Animal Care Committee)批准的方案 下护理动物。将年龄-和性别-匹配的小鼠和大鼠用于实验。需要医疗照顾的动物提供有适 当的兽医护理或执业的兽医的治疗并且从所述的研究中排除。
[0106] 体内切除创伤模型。将8-12周龄的动物用异氟烷麻醉。刮剃背部皮肤并用聚维酮 碘和70 %乙醇清洗。在小鼠中，将中线和在中线各侧I cm的四个点通过钢笔做标记。两个点 在肋缘水平，两个点在指定用于切除的部位的髂嵴处(图1A)。在大鼠中，四个切除创伤位于 中线任一侧Icm以及肋缘与髂嵴之间中点的上方和下方Icm(图7a)。将消毒的一次性活检穿 孔器(直径为5mm;Milte X)垂直对齐标记的中心，通过施加压力并且同时扭动穿通皮肤和肉 膜。重复相同程序，从而在每只动物上生成四处创伤(Tomlinson和Ferguson，2003)。在恢复 意识之后，将动物各自饲养。对于用夹板固定创伤的小鼠模型，在中背部上的中线的各侧进 行一个5mm切除。然后，将直径为创伤直径两倍的炸面圈形、0.5mm厚的娃酮夹板(Grace Bio-Laboratories，Bend，OR)居中、缝合并粘牢（KrazyG丨ue?;Elmer，s Inc ·，Columbus， OH)(图 IF;Gal iano等，2004)。
[0107] 对动物皮下注射AMD3100(AMD) (I · Omg kg-1，每两天，Sigma-Aldrich，St Louis， MO)或他克莫司（T)(0.Img kg'每天，购买自Johns Hopkins医院的药房）。从第0天至完全 闭合当天，将较高剂量的AMD(5.0mg kg^1，每两天)或T(1 .Omg kg'每天)施用至受伤小鼠 以测定剂量-响应。
[0108] 以指定的时间间隔对每个创伤部位数码拍照，并且使用Adobe Photoshop(版本 7.0;Adobe Systems，San Jose，CA)测定照片上的创伤区。将随着时间的推移创伤区的变化 表达为最初创伤区的百分比（图1B)。
[0109] 通过局部皮内注射抗-SDF-I抗体使SDF-I失活。在另外一系列实验中，在产生创伤 之后，在用双重药物疗法(AMD+低剂量的T)治疗之前，将含50μ1的15yg Hir1Uu等，2013)中 和的抗-SDF-I抗体(MAB310,R&D Systems ,Minneapolis，MN)的盐水皮内注射至右侧的两个 创伤，而将在左侧的其它两个创伤用等量的同种型匹配IgG(MCA 1209，AbD Serotec， Raleigh，NC)处理作为对照。将流体以每日一次注入接近创伤的皮肤并且注入创面，随后进 行组合方案治疗直至创伤闭合。在整个观察期，这些行为平行于单独用盐水处理的另一阴 性(媒介物)对照组。
[0110]组织学和显微术。在损伤之后第3天、第5天、第7天、第9天和第15天收集来自创伤 部位的组织。
[0111]谱系示踪研究:双重治疗的小鼠的创伤部位的CD 133+细胞的主要积聚（图3B)促 进使用体内谱系示踪系统以进一步探究CD 133+干细胞/祖细胞在皮肤再生中的作用。为激 活由CD133C-L基因座表达的CreERT2,从而不可逆地激活在CD133+细胞及其后代中GFP的表 达，在手术之前7天，将成年mT/mG; CD 133+/C-L-RosaEGFP小鼠腹膜内注射溶解于玉米油中 的5.0mg他莫昔芬(Sigma)(图6a;Muzumdar等，2007)。参考描述CD1