瘢痕内的新生毛囊。比例尺:200μπι Jb)大鼠愈合的瘢痕 (2mm)或未受损的皮肤内再生的毛囊的定量。数据表示每组η = 12个个体样本的平均值± SEM〇*p〈0.05〇
[0032] 图10示出⑶133+干细胞在双重治疗组的⑶133+/C-L小鼠的受伤皮肤中生成血管。 在创伤后第5天对CD133+/C-L创伤的相同切片进行同时的GFP-荧光(上图)、β-半乳糖苷酶 (中图)和Η&Ε染色(下图),表明CD133+祖细胞为新形成的毛细血管的来源之一,特别是在双 重治疗的CD133+/C-L小鼠中。右边显示出在较高放大倍数下的框区。箭头指向相同切片中 (GFP+,上图)、(IacZ+中图)、(Η&Ε,下图)的毛细血管。epi,表皮;we,创伤边缘。比例尺:200μ m〇
[0033] 图11示出在用盐水治疗、单独用低剂量的他克莫司(0.1mg/kg/剂量)治疗、 AMD3100(1.0mg/kg/剂量)单一疗法或者低剂量的他克莫司与AMD3100的组合治疗之后烧伤 皮肤的总的和显微镜可见的时程照片。在患糖尿病的大鼠(n = 4或5)中的皮肤创伤的代表 性照片显示出组合的疗法对增强创伤愈合的显著效果。
[0034]图12示出用低剂量的他克莫司和AMD3100的组合疗法改善小鼠烧伤之后的创伤闭 合。(a)在用盐水治疗、单独用低剂量的他克莫司(0.1mg/kg/剂量)治疗、AMD3100(1.0mg/ kg/剂量)单一疗法或者低剂量的他克莫司与AMD3100的组合治疗之后烧伤皮肤的总的和显 微镜可见的时程照片。在烧伤皮肤的小鼠(n = 7)中的代表性照片显示出组合的疗法对增强 烧伤创面的显著效果。(b)在烧伤之后连续多天定量创伤区。显示出平均值土SEM(Ii = T)^p 〈0.05双重治疗的小鼠对于媒介物治疗的小鼠。(c)用Kap Ian-Me i er存活分析来分析创伤闭 合(n = 7)〇
[0035]图13示出双重药物治疗降低烧伤后的瘢痕形成。显示出在烧伤后60天盐水和双重 药物-治疗的小鼠的瘢痕尺寸(1.44(^2)(11 = 3);照片(左图)和定量(右图)。实线表示瘢痕 边界。*P〈0.05。
【具体实施方式】
[0036] 应理解本发明不限于本文所述的特定方法和组分等,因为这些可以变化。还应理 解本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的,并且不意为限制本发明的范围。应注 意,如本文以及在所附权利要求中使用的,单数形式"一个/一种(a/an)"和"所述"包括复数 指代物,除非上下文中另外清楚地指定。因此,例如,提及的"蛋白质"是指一种或多种蛋白 质,并且包括本领域技术人员已知的它们的等同物等。
[0037]除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普 通技术人员通常理解的相同意义。描述了具体方法、装置和材料,但是与本文所述的那些方 法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明。
[0038] 本文引用的所有出版物据此通过引用并入,所述出版物包括所有期刊论文、书籍、 手册、公布的专利申请以及公布的专利。另外,提供了在说明书、实施例和所附权利要求中 使用的某些术语和短语的意义。定义在本质上并非意在限制性的并且用于提供本发明的某 些方面的更清楚的理解。
[0039] I、定义
[0040] "药剂"是指这样的所有材料,所述材料可以用作药物组合物或用在药物组合物中 或者可以为化合物,诸如小的合成的或天然来源的有机化合物、核酸、多肽、抗体、片段、亚 型、变体或为了此类目的单独使用的其它材料,所有依照本发明。
[0041] "拮抗剂"是指下调(例如,阻抑或抑制)蛋白质的至少一种生物活性的药剂。诘抗 剂可以为抑制或降低蛋白质与另一分子之间的相互作用的化合物,所述另一分子为例如, 靶标肽或酶底物。拮抗剂也可以为下调基因表达或降低存在的表达蛋白质的量的化合物。
[0042] "造血作用"是指血细胞形成和内稳态的高度协调过程。出生前,造血作用发生在 卵黄囊,然后肝脏以及最终骨髓中。在正常成人中,它发生在骨髓和淋巴组织中。所有血细 胞源自多能干细胞。多能细胞分化成定型至三种、两种或一种造血分化途径的干细胞。然 而,这些干细胞中没有一个是形态学上可区别的。
[0043]术语"免疫抑制剂"是指抑制、减缓或逆转免疫系统活性的药剂。免疫抑制剂通过 直接地(例如,通过作用于免疫细胞)或间接地(通过作用于其它调节细胞)阻抑响应的免疫 细胞(包括,例如,T细胞)的功能起作用。
[0044] 术语"干细胞"和"造血干细胞"在本文可互换使用。干细胞通过两个重要的特征区 别于其它细胞类型。首先,干细胞为能够通过细胞分裂、有时是在长期失活之后自我更新的 非特化细胞。第二,在特定生理或实验条件下,干细胞可被诱导变成具有特定功能的组织或 器官特异性细胞。在一些器官中,如肠和骨髓,干细胞有规律地分裂以修复和替代磨损或受 损组织。然而,在其它器官中,如胰脏和心脏,干细胞仅在特定条件下分裂。
[0045] 术语"干细胞"可指能够分化成包括红细胞、白细胞和血小板在内的所有血细胞的 多能干细胞。例如,本发明中使用的"造血干细胞"或"干细胞"不仅包含在骨髓中,而且还包 含在脐带血来源的细胞中。
[0046] 如本文所述,"干细胞动员齐If、"造血干细胞或祖细胞的动员齐If或"动员"(互换使 用)是指任何化合物,无论它是合成的或天然来源的小的有机分子或多肽,如生长因子或集 落刺激因子或它们的活性片段或模拟物、核酸、碳水化合物、抗体或起到增强干细胞从骨髓 迀移到外周血的任何其它药剂。干细胞动员剂可以增加外周血中造血干细胞或造血祖细 胞/前体细胞的数目,从而允许用于创伤愈合的干细胞的更可及的来源。在特定实施方式 中,干细胞动员剂是指动员CD34+和/或CD133+干细胞的任何药剂。在其它实施方式中,干细 胞动员剂破坏表达CXCR4的细胞的CXCLl 2 (SDF-I)-介导的化学诱导。
[0047] 待被本发明方法治疗的"患者"、"对象"或"宿主"是指人或非人动物,如灵长类、哺 乳动物和脊椎动物。
[0048] "小分子"是指分子量小于约3千道尔顿(kDa)、小于约1.5千道尔顿、或小于约1千 道尔顿的组合物。小分子可以为核酸、肽、多肽、模拟肽、碳水化合物、脂质或其它有机(含有 碳)或无机分子。"小的有机分子"为分子量小于约3千道尔顿、小于约1.5千道尔顿或小于约 IkDa的有机化合物(或者与无机化合物(例如,金属)复合的有机化合物)。
[0049] 如本文所用,术语"治疗(treatment)"、"治疗(treating)"、"治疗(treat)"等是指 获得期望的药理学和/或生理学效果。术语也用于施用"治疗有效量"的药剂(例如,干细胞 动员剂和/或免疫抑制剂)的上下文中。效果在完全或部分防止特定结果、疾病或其症状方 面可以为预防性的,和/或在部分或完全治愈疾病和/或归于疾病的不利影响方面可以为治 疗性的。如本文所用,"治疗"涵盖在对象中尤其是人类中的疾病的任何治疗,并包括:(a)防 止在可能有患病倾向但尚未诊断为患有该疾病的对象中的疾病发生;(b)抑制疾病,即阻止 其发展;以及(c)缓解疾病,例如,使疾病逆转,例如,完全或部分去除疾病症状。在特定实施 方式中,在促进或改善患者的创伤愈合的上下文中使用所述术语。
[0050] II、干细胞动员剂
[0051 ]本发明涉及用干细胞动员剂与免疫抑制剂组合治疗创伤。通常,干细胞动员剂包 括但不限于小的有机分子、多肽、核酸和碳水化合物。
[0052] 在多肽的情况下,干细胞动员剂可以包括细胞因子、集落刺激因子、蛋白酶或趋化 因子。更具体地,细胞因子可以包括但不限于白细胞介素-I(IL-I)、白细胞介素-3(IL_3)、 白细胞介素-6(11^-6)、白细胞介素-11(11^-11)、白细胞介素-7(11^-7)和白细胞介素-12 (IL12)〇
[0053] 在集落刺激因子的情况下,干细胞动员剂可以包括但不限于粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细 胞因子、FLT-3配体或它们的组合。
[0054]在另一实施方式中,蛋白酶干细胞动员剂可以包括但不限于金属蛋白酶(如MMP2 或MMP9)、丝氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶G或弹性蛋白酶)、半胱氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶K) 和二肽基肽酶-I (DDP-1或CD26)。
[0055] 在另一实施方式中,趋化因子干细胞动员剂可以包括但不限于CXCL12、IL-8、Mip-1α和GroP。
[0056] 在另一实施方式中,核酸干细胞动员剂为DNA或RNA分子。在更具体的实施方式中, 核酸可为小干扰RNA( s iRNA)分子或CXCLl 2特异的反义分子。
[0057] 在碳水化合物的情况下,干细胞动员剂可为硫酸化的碳水化合物,可以包括但不 限于岩藻多糖和硫酸化的葡聚糖。岩藻多糖为由摩尔比例为1:1.23:0.36的L-岩藻糖、硫酸 盐和乙酸盐组成的碳水化合物并且可分离自太平洋褐藻岩藻(Fucus evanescens)。参见 Bilan等,337(8)CARB0HYDRATE RESEARCH719-30(2002)。硫酸化的葡聚糖是指一系列具有 可变的硫酸化模式的多糖。参见,例如Pomin等,15(12)GLY⑶BIOLOGY 1376-1385(2005); Me Io等,279 (2 ) J · BIOL. CHEM. 20824-20835(2004);以及Farias等,275 (38) J.BIOL.CHEM.29299-29307(2000)。
[0058] 干细胞动员剂还可以包括但不限于AMD3100;间质细胞来源的因子(SDF-I) ;SDF-1 类似物(例如,CTCE_0214(Chemokine Therapeutics Corp.));抗-SDF-I抗体;环磷酰胺;干 细胞因子(SCF);非格司亭;安西司亭;骨髓祖细胞抑制因子-I(MPIF-I)(参见美国专利公布 号20080274109);以及极晚期抗原(VLA-4)拮抗剂(例如,α-4整合素拮抗剂,如抗体,包括那 他珠单抗或抗-磷酸-整合素a4(Ser988)、克隆6.33(Upstate Cell Signaling Solutions) 或肽(例如,苯基乙酰基-leu-asp-phe-D-脯氨酸酰胺(Cytel Corp.,San Diego Calif·)))。
[0059] 在特定实施方式中,干细胞动员剂包括CXCR4拮抗剂。在【具体实施方式】中,CXCR^g 抗剂为TG-0054(TaiGen Biotechnology有限公司(台北,台湾))。在其它【具体实施方式】中, CXCR4拮抗剂为AMD3465。在其它实施方式中,CXCR4拮抗剂为41?3100。舰03100(1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双-1,4,8,11-四氮杂环-十四烷)为CXCR4趋化因子受体的对称的双环 拉胺(bicyclam)、原型非肽拮抗剂。参见美国专利第6,835,731号和第6,825,351号。术语 "AMD"或"AMD3100"与普乐沙福、rINN、USAN、JM3100及其商品名Mozobil?互换使用。为了方 便,术语"普乐沙福"始终用于指CXCR4拮抗剂。
[0060] 本发明还预期使用AMD3100的模拟物。位于衬在CXCR4受体的主要配体结合袋的 TM-III、TM-IV、TM-V、TM-VI和TM-VII中在16个位置处的突变取代已经鉴别出以下三个酸残 基作为AMD3100的主要相互作用点:Asp mUspIV: 20)、Asp262 (AspVI: 23)和Glu288(GluVII: 06)。分子建模表明AMD3100的一个环拉胺环与TM-IV中的Asp m相互作用,然而其它环分别 夹在来自TM-VI和TM-VII的Asp262和Glu 288的羧酸基团之间。在一项研究中,发现在位置VII: 06处仅引入Glu以及在位置VII :02处去除中和的Lys残基致使AMD3100的亲和力增加1000倍 至CXCR4中AMD3100的亲和力的10倍内。因此,可设计模拟物,诸如例如,具有改善的口服生 物利用度的肽拮抗剂或非肽拮抗剂以有效地且选择性地阻断CXCR4受体。
[0061 ] 在其它实施方式中,干细胞动员剂为BKT140(Biokin Therapeutics,Ltd.(雷霍沃 特,以色列)。与用AMD3100获得的值相比,BKT140(4F-苯甲酰基-TN14003)结合并抑制具有 高亲和力的CXCR4趋化因子受体,显示出I C5q为约I nmo I /L。而且,与针对普乐沙福的I (:50值 为 51 ± 17nmol/L 相比,BKT140 阻碍 IC5Q值在 0.5nmol/L至 2.5nmol/L 内的 CXCL12 刺激的细胞 迀移,这表明高的动员能力。参见PeIed等,20CLIN · CANCER RES · 469-79 (2013)。
[0062] III、免疫抑制剂
[0063] 与干细胞动员剂相结合,免疫抑制剂可用于改善患者的创伤愈合。术语"免疫抑制 剂"是指抑制、减缓或逆转免疫系统活性的药剂。免疫抑制剂通过直接地(例如,通过作用于 免疫细胞)或间接地(通过作用于其它调解细胞)阻抑响应的免疫细胞(包括,例如T细胞)的 功能起作用。
[0064] 许多免疫抑制剂可用于改善患者的创伤愈合。此类免疫抑制剂包括但不限于钙神 经素抑制剂(例如,环孢菌素(CsA)及其类似物;ISA(TX)247和他克莫司(FK-506));硫唑嘌 呤(AZ);吗替麦考酚酯(MMF);咪唑立宾(MZ);来氟米特(LEF);肾上腺皮质类固醇(也被称为 肾上腺皮质激素类、皮质类固醇或类皮质激素)如泼尼松龙(prednisolon)和甲基泼尼松龙 (methylprednisolon);西罗莫司(也被称为雷帕霉素);依维莫司;FK778;TAFA-93;脱氧精 胍菌素(DSG);和FTY720(化学名称:2_氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]-1,3-丙二醇盐酸 盐)。
[0065] 在其它实施方式中,免疫抑制剂可包括但不限于环磷酰胺;15-脱氧精胍菌素 (Gusperimus)、干扰素、柳氮磺吡啶、mimoribine、米索前列醇、抗-IL-2受体抗体、沙立度胺 (thalidomide)、抗肿瘤坏死因子抗体、抗-CD2抗体、抗-CD147抗体、抗-CD4抗体、抗-CD8抗 体和抗胸腺细胞球蛋白抗体。免疫抑制剂还包括ORTHOCLONE? (0KT3)(0rth〇 Biotech,Raritan,N.J· )、SANDIMMUNE? ORAL(环孢菌素)(Sandoz Pharmaceuticals,Hanover,N.J· )、PROGRAF? (他克莫司)(Fujisawa Pharmaceuticals,迪尔菲尔德,II I )、CE,LLCEPT? (麦考酚酯)(Roche Pharmaceuticals,纳特利,N. J ·)和 RAPAMUNE?1(西罗莫司)(Wyeth,科利奇维尔, Pa.)。任选地,免疫抑制剂为雷帕霉素、他克莫司、霉酚酸、硫唑嘌呤或环磷酰胺。
[0066]免疫抑制剂还可包括白细胞介素-2α_链阻断剂(例如,巴利昔单抗和达珠单抗); 肌苷一磷酸脱氢酶的抑制剂(例如,吗替麦考酚酯);和二氢叶酸还原酶的抑制剂(例如,甲 氨蝶呤)。
[0067]在特定实施方式中,免疫抑制剂为他克莫司。他克莫司(也为FK-506或藤霉素)为 在同种异体的器官移植之后主要用于降低患者免疫系统的活性以及因此降低器官排斥风 险的免疫抑制药物。它通过T细胞降低白细胞介素-2(IL-2)的产生。还可将它用于治疗严重 的特应性皮炎(湿疹)、骨髓移植之后严重难治性葡萄膜炎和皮肤病况白癜风的