上含有T7RNA聚合酶基因的 菌株，转入的质粒为PVB12和pLTTC402,对于基因组上不含有T7RNA聚合酶基因的菌株，转 入的质粒为PVB12和pLTTC405.对所得重组工程菌，采用常规方法进行发酵培养，然后通过 如实施例2的方法进行液相色谱的方法均可检测出维生素 B12的合成。
[0283] 维生素 B12的发酵生产受培养条件如：培养基成分、培养温度、培养湿度、摇瓶转 速、培养方式（摇瓶培养或者发酵罐培养）和补料方式影响很大，所以仅列出产量最高时的 发酵条件
[0284] 假单胞菌（Pseudomonas spp.)转入pVB12和pLTTC405,得到重组菌，维生素 B12 产量为 40-400mg/L ;
[0285] 发酵条件：
[0286] 培养基（工业发酵培养基）成分：玉米浆（干物）10g/L，甜菜碱25g/L，磷酸氢二 铵0· 5g/L，蔗糖80g/L，硫酸铵1. 0g/L，尿素0· 5g/L，七水硫酸镁1. 75g/L，1 %七水硫酸锌 溶液 7mL/L，1 %六水氯化钴溶液 12mL/L，1 % 5, 6-DMB 溶液 9mL/L ;pH 7. 3-7. 4)。
[0287] 培养温度：30°C
[0288] 培养湿度：40%
[0289] 培养方式：发酵罐培养
[0290] 补料方式：
[0291 ] 补料成分：甜菜碱53g/L，蔗糖210g/L，1 %六水氯化钴溶液19. 6mL/L，1 % 5, 6-DMB 溶液 14. 3mL/L ;在 72h, 96h, 120h, 144 进行补料，每次 2ml。
[0292] 嗜盐单胞菌（Halomonas spp.)转入pVB12和pLTTC405,得到重组菌，维生素 B12 产量为 40-300mg/L ;
[0293] 发酵条件：
[0294] 培养基（工业发酵培养基）成分：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠60g/ L，蔗糖80g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1 %六水氯化钴溶液12mL/L，1 % 5, 6-DMB溶液 9mL/L ;pH 7. 3-7. 4。
[0295] 培养温度：37 °C
[0296] 培养湿度：40%
[0297] 培养方式：发酵罐培养
[0298] 补料方式：
[0299] 补料成分：甜菜碱53g/L，蔗糖210g/L，1 %六水氯化钴溶液19. 6mL/L，1 % 5, 6-DMB 溶液 14. 3mL/L ;在 72h, 96h, 120h, 144 进行补料，每次 2ml。
[0300] 罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha)转入pVB12和pLTTC405,得到重组菌，维生 素 B12 产量为 50-200mg/L ;
[0301] 发酵条件：
[0302] 培养基（工业发酵培养基）成分：：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/ L，蔗糖80g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1 %六水氯化钴溶液12mL/L，1 % 5, 6-DMB溶液 9mL/L ;pH 7. 3-7. 4。
[0303] 培养温度：30°C
[0304] 培养湿度：40%
[0305] 培养方式：发酵罐培养
[0306] 补料方式：
[0307] 补料成分：甜菜碱53g/L，蔗糖210g/L，1 %六水氯化钴溶液19. 6mL/L，1 % 5, 6-DMB 溶液 14. 3mL/L ;在 72h, 96h, 120h, 144 进行补料，每次 2ml。
[0308] 气生单胞菌（Aeromonas spp.)转入pVB12和pLTTC405,得到重组菌，维生素 B12 产量为 40-200mg/L ;
[0309] 发酵条件：
[0310] 培养基（工业发酵培养基）成分：：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/ L，蔗糖80g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1 %六水氯化钴溶液12mL/L，1 % 5, 6-DMB溶液 9mL/L ;pH 7. 3-7. 4。
[0311] 培养温度：30°C
[0312] 培养湿度：40%
[0313] 培养方式：发酵罐培养
[0314] 补料方式：
[0315] 补料成分：甜菜碱53g/L，蔗糖210g/L，1 %六水氯化钴溶液19. 6mL/L，1 % 5, 6-DMB 溶液 14. 3mL/L ;在 72h, 96h, 120h, 144 进行补料，每次 2ml。
[0316] 结果各种重组菌中维生素 B12的产量范围为40mg/L-400mg/L。
[0317] 粘着剑菌（Ensifer spp.)转入pVB12和pLTTC405,得到重组菌，维生素 B12产量 为 40_400mg/L ;
[0318] 发酵条件：
[0319] 培养基（工业发酵培养基）成分：玉米浆（干物）10g/L，甜菜碱25g/L，磷酸氢二 铵0· 5g/L，蔗糖80g/L，硫酸铵1. 0g/L，尿素0· 5g/L，七水硫酸镁1. 75g/L，1 %七水硫酸锌 溶液 7mL/L，1 %六水氯化钴溶液 12mL/L，1 % 5, 6-DMB 溶液 9mL/L ;pH 7. 3-7. 4)。
[0320] 培养温度：30°C
[0321] 培养湿度：40%
[0322] 培养方式：发酵罐培养
[0323] 补料方式：
[0324] 补料成分：甜菜碱53g/L，蔗糖210g/L，1 %六水氯化钴溶液19. 6mL/L，1 %
【主权项】
1. 一种构建重组菌的方法，为1)或2): 1) 所示的方法，包括如下步骤：将至少如下18个酶的编码基因或如下18个酶的编码 基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌A中，得到重组菌A ; 所述18个酶的编码基因为：前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉3B甲基转移酶的编 码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶 的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、钴啉酸 a，c-二酰胺合成酶的编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯合酶S的编码基因、 钴离子螯合酶T的编码基因、二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶的编码基因、5-氨基乙酰丙酸 合成酶的编码基因、氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉 原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和前咕啉2甲基转移酶的编码 基因； 所述目的菌A为不表达如下5个基因的菌：氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原 脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和 前咕啉2甲基转移酶的编码基因； 2) 所示的方法，包括如下步骤：将至少如下13个酶的编码基因或如下13个酶的编码 基因中任意一个或多个的组合共同的导入目的菌B中，得到重组菌B ; 所述13个酶的编码基因为：前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉3B甲基转移酶的编 码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶 的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、钴啉酸 a，c-二酰胺合成酶的编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯合酶S的编码基因、 钴离子螯合酶T的编码基因、二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶的编码基因和5-氨基乙酰丙 酸合成酶的编码基因。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕 啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基 因、前咕啉6A还原酶的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶 的编码基因、钴啉酸a，c-二酰胺合成酶的编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯 合酶S的编码基因、钴离子螯合酶T的编码基因和二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶的编码基 因共12个基因通过重组表达载体甲导入所述目的菌A或所述目的菌B中； 所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因通过重组表达载体乙导入所述目的菌A中或 通过重组表达载体丙导入所述目的菌B ; 所述氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶 的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和前咕啉2甲基转移酶的编码基因共5 个基因通过重组表达载体丁导入所述目的菌A中。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体甲为将含有所述12个 基因的DNA分子插入表达载体，得到重组载体；所述插入方式为同源重组； 所述含有所述12个基因的DNA分子包括由所述前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉 6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因组成的融合DNA片段融合DNA片段甲、 驱动所述融合DNA片段甲表达的T7启动子、由前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉6Y 甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因的DNA片段组成的融合DNA片段 乙、驱动所述融合DNA片段乙表达的T7启动子、由钴啉酸a，c-二酰胺合成酶的编码基因、 所述前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、所述钴离子螯合酶N的编码基因组成的融合DNA片 段丙、驱动所述融合DNA片段丙表达的gltA启动子、由所述钴离子螯合酶S的编码基因、所 述钴离子螯合酶T的编码基因和所述二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶的编码基因组成的融 合DNA片段丁、驱动所述融合DNA片段丁表达的gltA启动子； 所述重组表达载体乙为将所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因插入表达载体中得 到的载体； 所述重组表达载体丙为重组表达载体乙基因组上的KanR基因替换为CmR基因，且将所 述T7RNA聚合酶基因插入所述重组表达载体乙中，得到的载体； 所述重组表达载体丁为将含有所述5个基因的DNA分子插入表达载体中得到的重组载 体。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于： 所述含有所述12个基因的DNA分子的核苷酸序列具体为序列1 ; 所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2 ; 所述含有所述5个基因的DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列3。5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于： 所述目的菌A为大肠杆菌、大肠杆菌突变菌、嗜盐单胞菌、罗氏真养杆菌或气生单胞 菌； 所述目的菌B为假单胞菌或粘着剑菌。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于： 所述大肠杆菌突变菌为将大肠杆菌E. coli BL21DE3基因组上T7RNA聚合酶氨基酸序 列第756位的R替换为S，得到的突变菌。7. 由权利要求1-6中任一所述的方法制备的重组菌A或重组菌B。8. 权利要求7所述的重组菌A在制备维生素 B12或制备维生素 B12的卟啉前体物质中 的应用； 或权利要求7所述的重组菌B提高维生素 B12中的应用。9. 一种制备维生素 B12或维生素 B12的卟啉前体物质的方法，包括如下步骤：发酵权 利要求7所述的重组菌A ; 或一种制备维生素 B12或提高维生素 B12的方法，包括如下步骤：发酵权利要求7所述 的重组菌B。
【专利摘要】本发明公开了一种提高维生素B12产量重组菌的构建方法及其应用，本发明提供的方法，为1)或2)：1)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下18个酶的编码基因或如下18个酶的编码基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌A中，得到重组菌A；2)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下13个酶的编码基因或如下13个酶的编码基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌B中，得到重组菌B。本发明将13或18种维生素B12合成所需要的基因导入宿主菌中，通过摇瓶实验可以检测到各种重组菌中维生素B12的产量均得到了各种不同程度的提高，各种重组菌维生素B12的产量范围为44mg/L-400mg/L。
【IPC分类】C12P19/42, C12N15/78, C12R1/01, C12N1/21, C12R1/38, C12R1/19, C12N15/74, C12N15/70
【公开号】CN105647950
【申请号】
【发明人】陈国强, 郭瑛瑛, 李天
【申请人】清华大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年11月10日