一种提高维生素b12产量重组菌的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种提高维生素 B12产量重组菌的构建方法及其 应用。
【背景技术】
[0002] 利用代谢工程技术改造微生物已成为一种行之有效的方法来生产化学产品。维 生素 B12,又称钴胺素（cyanocobalamin)，是一种含有钴的咕啉类有机化合物，分子式 C63HSSC〇N14014P。维生素 B12是人体组织代谢过程中所必需的维生素，是人和其它哺乳动物 维持生长和促进红细胞生长的重要因子，在临床上用于治疗恶性贫血和恢复造血功能等。 由于维生素 B12的结构极为复杂，其化学合成高度繁琐昂贵，从肝脏等动物组织提取的效 率和效益也十分低下，所以只能通过微生物发酵法来实现商业化生产。但是由于其代谢途 径复杂，因此至今没有报道能对维生素 B12的整个代谢途径进行调控。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供构建重组菌的方法。
[0004] 本发明提供一种构建重组菌的方法，为1)或2):
[0005] 1)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下18个酶的编码基因或如下18个酶的 编码基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌A中，得到重组菌A ;
[0006] 所述18个酶的编码基因为：前咕啉3B合成酶的编码基因（cobG基因）、前咕啉3B 甲基转移酶的编码基因（cobj基因）、前咕啉4甲基转移酶的编码基因（cobM基因）、前咕 啉6A合成酶的编码基因（cobF基因）、前咕啉6A还原酶的编码基因（cobK基因）、前咕啉 6Y甲基转移酶的编码基因（cobL基因）、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因（cobH基因）、 钴啉酸a，c_二酰胺合成酶的编码基因（cobB基因）、钴离子螯合酶N的编码基因（cobN基 因）、钴离子螯合酶S的编码基因（cobS基因）、钴离子螯合酶T的编码基因（cobT基因）、 二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶的编码基因（cobR基因）、5_氨基乙酰丙酸合成酶的编码基 因（heml基因）、氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因（hemB基因）、胆色素原脱氨酶的编码基 因（hemC基因）、尿卟啉原合成酶的编码基因（hemD基因）、尿卟啉原III甲基转移酶的编 码基因（cobA基因）和前咕啉2甲基转移酶的编码基因（cobl基因）；
[0007] 所述目的菌A为不表达如下5个基因的菌：氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色 素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基 因和前咕啉2甲基转移酶的编码基因；
[0008] 2)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下13个酶的编码基因或如下13个酶的 编码基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌B中，得到重组菌B ;
[0009] 所述13个酶的编码基因为：前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉3B甲基转移酶 的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还 原酶的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、钴 啉酸a，c-二酰胺合成酶的编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯合酶S的编码 基因、钴离子螯合酶T的编码基因、二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶的编码基因和5-氨基乙 酰丙酸合成酶的编码基因；
[0010] 所述目的菌B为表达如下5个基因的菌：氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素 原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因 和前咕啉2甲基转移酶的编码基因。
[0011] 上述方法中，
[0012] 所述前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲 基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因、前咕啉 6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、钴啉酸a，c-二酰胺合成酶的 编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯合酶S的编码基因、钴离子螯合酶T的编 码基因和二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶的编码基因共12个基因通过重组表达载体甲导入 所述目的菌A或所述目的菌B中；
[0013] 所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因通过重组表达载体乙导入所述目的菌A 中或通过重组表达载体丙导入所述目的菌B ;
[0014] 所述氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合 成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和前咕啉2甲基转移酶的编码基因 共5个基因通过重组表达载体丁导入所述目的菌A中。
[0015] 所述重组表达载体甲（pVB12)为将含有所述12个基因的DNA分子插入表达载体 (命名为甲，为穿梭载体PRS424)，得到重组载体；所述插入方式为同源重组；
[0016] 其中同源重组上游同源臂为序列1自5'末端第1-19位核苷酸，同源重组下游同 源臂为序列1自5'末端第17565-17604位核苷酸。
[0017] 所述含有所述12个基因的DNA分子包括由所述前咕啉3B合成酶的编码基因、前 咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因组成的融合DNA片段融合DNA片段 甲、驱动所述融合DNA片段甲表达的T7启动子、由前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕 啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因的DNA片段组成的融合DNA 片段乙、驱动所述融合DNA片段乙表达的T7启动子、由钴啉酸a，c-二酰胺合成酶的编码基 因、所述前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、所述钴离子螯合酶N的编码基因组成的融合DNA 片段丙、驱动所述融合DNA片段丙表达的gltA启动子、由所述钴离子螯合酶S的编码基因、 所述钴离子螯合酶T的编码基因和所述二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶的编码基因组成的 融合DNA片段丁、驱动所述融合DNA片段丁表达的gltA启动子；
[0018] 所述重组表达载体乙（PLTTC402)为将所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因插 入表达载体（命名为乙，为pET28a)中得到的载体；
[0019] 所述重组表达载体丙（PLTTC405)为重组表达载体乙基因组上的KanR基因替换为 CmR基因，且将所述T7RNA聚合酶基因插入所述重组表达载体乙中，得到的载体；
[0020] 所述重组表达载体丁（pUKBCDAI)为将含有所述5个基因的DNA分子插入表达载 体（命名为丁，为pUKFRT)中得到的重组载体。
[0021] 上述方法中，
[0022] 所述含有所述12个基因的DNA分子的核苷酸序列具体为序列1 ;
[0023] 所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2 ;
[0024] 所述含有所述5个基因的DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列3。
[0025] 上述方法中，
[0026] 所述目的菌A为大肠杆菌、大肠杆菌突变菌、嗜盐单胞菌、罗氏真养杆菌或气生单 胞菌；
[0027] 所述目的菌B为假单胞菌或粘着剑菌。
[0028] 上述方法中，
[0029] 所述大肠杆菌突变菌为将大肠杆菌E. coli BL21DE3基因组上T7RNA聚合酶氨基 酸序列第756位的R替换为S，得到的突变菌；
[0030] 由上述的方法制备的重组菌A或重组菌B也是本发明保护的范围。
[0031] 上述的重组菌A在制备维生素 B12或制备维生素 B12的卟啉前体物质中的应用也 是本发明保护的范围；
[0032] 或上述的重组菌B提高维生素 B12中的应用也是本发明保护的范围。
[0033] 本发明另一个目的是提供一种制备维生素 B12或维生素 B12的卟啉前体物质的方 法。
[0034] 本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌A ;
[0035] 本发明第三个目的是提供一种制备维生素 B12或提高维生素 B12的方法。
[0036] 本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌B。
[0037] 上述发酵条件如下：
[0038] 将重组菌A接种在LBG维生素 B12发酵培养基中，至其初始浓度0D600为0. 1， 37°C，250rpm(旋转半径为50mm)，摇瓶培养168小时；
[0039] 将重组菌B接种在工业发酵培养基中，至其初始浓度为0D600为0. 1，37°C， 250rpm(旋转半径为50mm)，摇瓶培养168小时；
[0040] 不同目的菌发酵条件不同，具体见实施例。
[0041] 本发明中使用过宿主在本发明中，所述的编码维生素 B12的合成基因如hemB, hem C，hemD，cobA，cobl，cobG，cobj，cobM，cobF，cobK，cobL，cobH，cob, cobNST，cobR，heml 等，可 以是野生的基因，也可以是人工合成的核苷酸序列，编码基因的密码子可以按照不同的宿 主的偏好进行优化。
[0042] 本发明的实验证明，本发明将13种维生素 B12合成所需要的基因通过电击转化 法、化学转化法或氯化锂转化法导入宿主菌中，通过摇瓶实验可以检测到各种重组菌中维 生素 B12的产量均得到了各种不同程度的提高，各种重组菌维生素 B12的产量范围为44mg/ L_400mg/L。
【附图说明】
[0043] 图1为葡萄糖转化为维生素 B12的转化关系
[0044] 左边的通路代表细菌自身含有的糖酵解和TCA循环通路；
[0045] 其中，heml :5_氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因；hemB :氨基乙酰丙酸脱氢酶的编 码基因；hemC :胆色素原脱氨酶的编码基因；hemD :尿卟啉原合成酶的编码基因；cobA :尿 卟啉原III甲基转移酶的编码基因；cobl :前咕啉2甲基转移酶的编码基因；cobG :前咕啉 3B合成酶的编码基因 ；cobj :前咕啉3B甲基转移酶的编码基因 ；cobM :前咕啉4甲基转移 酶的编码基因 ；cobF :前咕啉6A合成酶的编码基因 ；cobK :前咕啉6A还原酶的编码基因； cobL :前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因；cobH:前咕啉8X甲基异位酶的编码基因 ；cobB :钴 啉酸a，c-二酰胺合成酶的编码基因 ；cobNST :钴离子螯合酶的编码基因 ；cobR :二价钴啉 酸a，c-二酰胺还原酶的编码基因 cobOQDPVS基因均为细菌自身所有。
[0046] 图2为重组菌A维生素 B12的产量
[0047] 图3为重组菌B提高维生素 B12的产量
【具体实施方式】
[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050] 下述实施例序列1为与重组载体PRS424同源重组的片段（包含pVB12上的12个 基因，T7启动子和gltA启动子）；序列2为优化后的heml基因序列；序列3为插入克隆载 体pUKFRT骨架的DNA序列；序列4为T7RNA聚合酶序列；序列5为Cm抗性基因；序列6为 P⑶G质粒序列；序列7为pUKFRT序列；序列8为优化后的cobG基因序列；序列9为优化后 的cobJ基因序列；序列10为优化后的cobM基因序列；序列11为优化后的cobF基因序列； 序列12为优化后的cobK基因序列；序列13为优化后的cobL基因序列；序列14为优化后 的cobH基因序列；序列15为优化后的cobB基因序列；序列16为优化后的cobN基因序列； 序列17为优化后的cobS基因序列；序列18为优化后的cobT基因序列，序列19为优化后 的cobR基因序列；序列20为优化后的hemB基因序列；序列21为优化后的hemC基因序列； 序列22为优化后的hemD基因序列；序列23为优化后的cobA基因序列；序列24为优化后 的cob I基因序列。
[0051] 在本发明中，在所述重组菌构建方法中，氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因 （hemB 基因）、胆色素原脱氨酶的编码基因（hemC基因）、尿卟啉原合成酶的编码基因（hemD基 因）、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因（cobA基因）、前咕啉2甲基转移酶的编码基因 (cobl基因）这五个基因是以基因组整合的方式插入到了重组菌A的基因组上；前咕啉3B 合成酶的编码基因（c