cobj，cobL，cobM和pUK骨架片段，得到酶 切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌 E.coli Transl-Tl中，得到转化子，提取转化子的质粒，经过测序，质粒为将序列1自5' 末端第3306-6131位核苷酸（cobj基因、cobL基因、cobM基因的DN片段）插入克隆载体 pUK(该质粒为克隆质粒，记载于"Shi ZY. Parallel DNA Assembly by Recombination. PhD thesis. 2012. University of Melbourne, Melbourne" 一文中，公众可从清华大学获得，构 建过程中PCR引物上引入T7启动子）的Drain酶切位点得到的载体，命名为重组载体 pUKJLM〇
[0099] 4)、克隆载体p⑶BHN的构建
[0100] 以合成的质粒pUC57cobB，pUC57cobH和pUC57cobN为模板，使用下表中的引物，用 phusion酶进行PCR反应扩增目的基因 cobB, cobH和cobN,并在引物两端设计引物酶切位 点DrallI.以p⑶G为模板，使用下表中的p⑶GF和p⑶GR为引物，用phusion酶进行PCR反 应扩增载体骨架pCDG，pCDG的骨架上含有gltA启动子。构建过程所需引物均列在表3中
[0101] 表3.为克隆载体pCDBHN构建所需引物
[0102]
[0103] 上表中单下划线标注的是酶切位点。
[0104] PCR反应体系（20 μ L体系）：模版DNA 0. 4μ L ;上游引物0. 5 μ L ;下游引物 0.5yL;pfu buffer 2.0yL;phusion 酶 0.2yL;dNTP 1.5yL;ddH20补足至 20yL。PCR 扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0105] PCR反应条件：先98 °C预变性5分钟；再98 °C变性30秒，58 °C退火30秒，72 °C延 伸lKb/30sec，30次循环；然后72°C后延伸10分钟。
[0106] 用Dralll酶切上述PCR反应得到的cobB，cobH，cobN和pUK骨架片段，得到酶 切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌 E.coli Transl-Tl中，得到转化子，提取转化子的质粒，经过测序，质粒为将序列1自5'末 端第7176-12996位核苷酸（含cobB基因、cobH基因、cobN基因的DNA片段）插入克隆载 体pCDG(本实验室构建见序列6,骨架带有gltA启动子）的Drain酶切位点得到的载体， 命名为重组载体P⑶BHN。
[0107] 5)克隆载体pEasyGSTR的构建
[0108] 以合成的质粒pUC57cobR，pUC57cobS和pUC57cobT为模板，使用下表中的引物，用 phusion酶进行PCR反应扩增目的基因 cobR，cobS和cobT，并在引物两端设计引物酶切位 点Drain.以pCDG为模板，使用下表中的gltAF和gltAR为引物，用phusion酶进行PCR 反应扩增gltA启动子，以pEASY-Blulnt为模板，使用下表中的pEasyF和pEasyR为引物， 用phusion酶进行PCR反应扩增pEASY-Blulnt的载体骨架。构建过程所需引物均列在表 4中
[0109] 表4克隆载体pEasyGSTR构建所需引物
[0110]
[0111] 上表中单下划线标注的是酶切位点。
[0112] PCR反应体系（20 μ L体系）：模版DNA 0. 4 μ L ;上游引物0. 5 μ L ;下游引物 0.5yL;pfu buffer 2.0yL;phusion 酶 0.2yL;dNTP 1.5yL;ddH20补足至 20yL。PCR 扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0113] PCR反应条件：先98°C预变性5min ;再98°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸 lKb/30sec，30次循环；然后72°C后延伸10分钟。
[0114] 用Dralll酶切上述PCR反应得到的gltA启动子，cobS, cobT, cobR和 pEasy-Blulnt骨架片段，得到酶切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反 应，将连接产物转化到大肠杆菌E. coli Transl-Tl中，得到转化子，提取转化子的质粒，经 过测序，质粒为将序列1自5'末端第13977-17559位核苷酸（为含gltA启动子、cobS基 因、cobT基因和cobR基因的DNA片段）插入克隆载体pEASY-Blulnt (北京鹏林生物技术 有限责任公司，产品目录分别为CB111-02)的Drain酶切位点（确认）得到的载体，命名 为重组载体pEasyGSTR。
[0115] 6)、重组表达载体pVB 12的构建
[0116] 以构建成功的四个克隆载体pUC19GFK，pUKJLM，pCDBHN和pEasyGSTR为模板，用表 5所示的引物，利用phusion聚合酶克隆得到T7-GFK，T7-JLM，gltA-BHN和gltA-STR四个 DNA大片段；以酵母中的穿梭载体pRS424 (普如汀生物技术有限公司，Biovector-168625) 为模板，用下表中的PRS424F和pRS424R为引物，利用phusion聚合酶克隆得到酵母的穿梭 载体PRS424的骨架。构建过程中所使用的引物均列在表5中。
[0117] 表5为重组表达载体pVB12构建所需引物
[0118]
[0119] 将T7-GFK、T7-JLM、gltA-BHN、gltA-STR和穿梭载体pRS424骨架转入到酵母细胞 中，利用酵母细胞自己的同源重组机制，连接成最后的重组表达载体PVB12。
[0120] 二、重组表达载体PLTTC402的构建
[0121] 1)、heml基因的密码子优化和合成
[0122] 在NCBI网站上提取来源于酵母菌的heml基因的基因序列，基因的NCBI gene ID 是 851818。然后用常用密码子优化网站 Opitimizer(http://genomes. urv. es/OPTIMIZER) 根据大肠杆菌的密码子偏好进行了核苷酸序列优化，优化后得到的序列可见序列表中2,得 到的序列送往上海青蓝公司进行合成，基因合成在青蓝公司的通用载体PUC57上。
[0123] 2)、重组表达载体pLTTC402的构建
[0124] 以合成的质粒pUC hemlCO为模板，使用下表中的引物，用phusion酶进行PCR反 应扩增目的基因 heml，并在引物两端设计引物酶切位点BamHI和Hindlll。构建过程中所 使用的引物列在表6中。
[0125] 表6.为重组表达载体pLTTC402构建所需引物
[0126]
[0127] 上表中单下划线标注的是酶切位点。
[0128] PCR反应体系（20 μ L体系）：模版DNA 0. 4 μ L ;上游引物0. 5 μ L ;下游引物 0.5yL;pfu buffer 2.0yL;phusion 酶 0.2yL;dNTP 1.5yL;ddH20补足至 20yL。PCR 扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0129] PCR反应条件：先98 °C预变性5分钟；再98 °C变性30秒，58 °C退火30秒，72 °C延 伸lKb/30sec，30次循环；然后72°C后延伸10分钟。
[0130] 用BamHI和Hindlll酶切上述PCR反应得到的hemlCO片段，用同样的酶切位点酶 切载体pET28a，得到酶切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接 产物转化到大肠杆菌E. coli Transl-Tl中，得到转化子，提取转化子的质粒。
[0131] 经过测序,质粒为将序列2所示的heml基因插入表达载体pET28a的BamHI和 HindllI酶切位点间得到的载体，命名为重组表达载体pLTTC402。
[0132] 三、工程菌 E. coli BL21DE3MBCDAI 的构建
[0133] 工程菌 E. coli BL21DE3MBCDAI 为将大肠杆菌 E. coli BL21DE3 基因组上 T7RNA 聚 合酶氨基酸序列第756位的R替换为S，且将hemB，hemC，hemD，cobA，cobl这5个基因整合 在大肠杆菌E. coli BL21DE3的基因组上得到的重组菌。
[0134] 具体构建方法如下：
[0135] 1、重组整合载体pUKBCDAI的构建
[0136] 重组整合载体pUKBCDAI为将序列表中序列3所示的DNA分子插入克隆载体 pUKFRT骨架的Drain酶切位点间，得到重组载体。
[0137] 序列3所不的DNA分子包括hemB基因 、hemC基因 、hemD基因 、cobA基因 、cobl基 因，其中，hemB基因的核苷酸序列为序列表中序列3自5'末端第700-1674位核苷酸，hemC 基因的核苷酸序列为序列表中序列3自5'末端第1697-2641位核苷酸，hemD基因的核苷 酸序列为序列表中序列3自5'末端第2667-3455位核苷酸，cobA基因的核苷酸序列为序 列表中序列3自5'末端第4243-5085位核苷酸，cobl基因的核苷酸序列为序列表中序列3 自5'末端第5111-5848位核苷酸。
[0138] 1)、五个基因的密码子优化和合成
[0139] 在NCBI网站上提取5个基因的基因序列，这些基因的NCBI gene ID分 别是 hemB (GI :936972)、hemC (GI :937488)、hemD (GI :938324)、cobA (GI: 151146)、 cobl (GI: 151174)。然后用常用密码子优化网站 Opitimizer (http://genomes. urv. es/ OPTIMIZER)根据大肠杆菌的密码子偏好进行了核苷酸序列优化.优化后的序列见序列表 20-24.在优化后的基因序列前添加核糖体结合序列进行修饰（AGGAGGTAAAAAA)最后得到 的序列送往上海青蓝公司进行合成，每单个基因合成在青蓝公司的通用载体PUC57上。
[0140] 2)、重组整合载体pUKBCDAI的构建
[0141] 以合成的质粒 pUC57hemB, pUC57hemC, pUC57hemD, pUC57cobA 和 pUC57cobI 为模 板，使用下表中的引物，用phusion酶进行PCR反应扩增目的基因 hemB, hemC, hemD, cobA和 cobl.并在引物两端设计引物酶切位点Drain。以pUKFRT为模板，使用下表中的pUKFRTF 和pUKFRTR为引物，用phusion酶进行PCR反应扩增的pUKFRT载体骨架。构建过程所需引 物均列在表7中。
[0142] 表7为重组整合载体pUKBCDAI构建所需引物
[0143]
[0144]
[0145] 上表中单下划线标注的是酶切位点。
[0146] PCR反应体系（20 μ L体系）：模版DNA 0. 4μ L ;上游引物0. 5 μ L ;下游引物 0.5yL;pfu buffer 2.0yL;phusion 酶 0.2yL;dNTP 1.5yL;ddH20补足至 20yL。PCR 扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0147] PCR反应条件：先98 °C预变性5分钟；再98 °C变性30秒，58 °C退火30秒，72 °C延 伸lKb/30sec，30次循环；然后72°C后延伸10分钟。
[0148] 用 Drain 酶切上述 PCR 反应得到的 hemB，hemC, hemD, cobA, cobl 和 pUKFRT 骨架 片段，得到酶切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化 到大肠杆菌E. coli Transl-Tl中，得到转化子，提取转化子的质粒。
[0149] 经过测序，质粒为将序列表中序列3所示的DNA分子插入克隆载体pUKFRT (该载 体的核苷酸序列见序列7)骨架上，得到重组整合