A标样* 1 · 1
[0218] C样品-样品中维生素 B12的浓度（ug/ml)
[0219] Cs#-氰钴胺标准品溶液的浓度（ug/ml)
[0220] As# -标准品液相色谱峰面积
[0221 ] A -样品中亚硫酸钴胺色谱峰面积
[0222] 因为测定使用的标样为氰钴胺,而检测的位置为亚硫酸钴胺，1. 1为实验的校正因 子。
[0223] 6)、结果显示：
[0224] 发酵液中的腺苷维生素 B12与8%的偏重亚硫酸钠水溶液在光照反应下会生成较 稳定的亚硫钴维生素 B12,在液相检测中，发现在亚硫钴出峰的位置检测到了有峰出现。
[0225] 在实验过程中还发现了含有PVB12质粒的重组菌对重金属钴离子的耐受性大大 提高，重金属钴离子是维生素 B12结构组成的必要成分，但是一般的二价金属钴离子会对 细胞具有毒性，而PVB12质粒上的cobR基因（二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶）可以将二 价的钴还原为一价钴，从而降低钴离子的毒性，使得重组菌的细胞干重显著提高，具体结果 见图2所示。另外在重组菌A的发酵液中检测到了维生素 B12的卟啉前体物质（卟啉前体 物质在液相检测上与亚硫酸钴胺的出峰位置相近，而且均具有550nm的紫外吸收峰，因此 卟啉前体物质的计算方式可以按照亚硫酸钴胺来进行计算），其含量为20mg/L.
[0226] 实施例3、可提高维生素 B12产量的重组工程菌B的构建以及验证过程
[0227] 一、重组表达载体pLTTC405的构建
[0228] 重组表达载体pLTTC405为将重组表达载体pLTTC402上的KanR基因替换为CmR 基因，且将T7RNA聚合酶基因插入重组表达载体pLTTC402的AsiSI和Clal酶切位点间得 到的载体。
[0229] 1).使用Gibson连接方法，替换表达载体pLTTC402上的KanR基因为CmR基因（序 列5)。
[0230] 以质粒pl5A为模板，使用下表中的引物CAT-GF和CAT-GR，用QP> High-Fidelity2X Master Mix酶进行PCR反应扩增目的基因 CmR。构建过程中所使用的引 物列在下表9中。
[0231] 表9.重组表达载体pLTTC405构建所需引物
[0232]
[0233] PCR反应体系（20 μ L体系）：模版DNA 0. 1 μ L ;上游引物0. 4 μ L ;下游引物 0.4yL; Q:5? High-Fidelity 2Χ Master Mix 酶 10 μ L;ddH20 补足至 20 μ L。PCR 扩增体 系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0234] PCR反应条件：先98°C预变性30秒；再98°C变性10秒，60. 7°C退火30秒，72°C延 伸lKb/3〇sec，30次循环；然后72°C后延伸2分钟。
[0235] 用AsiSI和Clal酶切位点酶切载体pLTTC4,得到酶切产物，然后加入扩增好的 CmR片段，使用NEB的Gibson Assembly? Master Mix进行连接反应，将连接产物转化到大 肠杆菌E. coli Transl-Tl中，得到转化子，提取转化子的质粒，测序，结果为CmR片段基因 成功的连接到了载体PLTTC402上，得到中间载体pLTTC402-CmR。
[0236] 2).使用Gibson连接方法，将T7RNA聚合酶基因连接到上一步构建的载体上。
[0237] 以E. coli BL21DE3基因组为模板，使用下表中的引物T7pF和T7pR，用QS? High-Fidelity 2X Master Mix酶进行PCR反应扩增3652bp目的基因 T7RNA聚合酶基因 (序列4)。构建过程中所使用的引物列在下表10中。
[0238] 用Drain和Nsil酶切位点酶切上述1)制备的中间载体pLTTC402_CmR，得到酶 切产物，然后加入扩增好的T7RNA聚合酶基因片段，使用NEB的Gibson Assembly? Master Mix进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌E. coli Transl-Tl中，得到转化子，提取转 化子的质粒，测序，结果为T7RNA聚合酶基因成功的连接到了上一步构建的载体上。
[0239] 表10.重组表达载体PLTTC405构建所需引物2
[0240]
[0241 ] PCR反应体系（20 μ L体系）：模版DNA 0. 1 μ L ;上游引物0. 4 μ L ;下游引物 0.4yL; Q5? High-Fidelity 2Χ Master Mix 酶 10 μ L;ddH20 补足至 20 μ L。PCR 扩增体 系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0242] PCR反应条件：先98°C预变性30秒；再98°C变性10秒，61.0°C退火30秒，72°C延 伸lKb/3〇sec，30次循环；然后72°C后延伸2分钟。
[0243] 二、重组工程菌的构建
[0244] 将实施例1的步骤一制备的重组表达载体pVB12和步骤二构建的pLTTC405 (两种 质粒的摩尔比为1 :1)用电转化法转入到假单胞菌P. denitrificans中，得到重组菌B。
[0245] 将重组菌B涂布于LB-Amp-Cm的固体培养平板上，在37 °C静置培养48小时，挑取 在固体平板上长出的单克隆接种到LB-Amp-Cm液体培养基中，在37°C、200rpm下摇床培养 12小时，得到重组菌B。
[0246] 从重组菌B提取质粒，采用PCR进行分子鉴定。以提取质粒为模板，以hemBF/hemBR 和cobGF/cobGR为验证引物。
[0247] cobGF :5,-ATGACCGACCTGATGACCT-3,；
[0248] cobGR :5,-CTAACCCTGTTCGAACGCC-3,；
[0249] hemlF :5' -ATGCAGCGTTCTATCTT-3' ；
[0250] hemlR :5, -TTACTGTTTGATACCAG-3'
[0251] PCR反应体系（10yL体系）：质粒DNA 0.2yL;上游引物0.25yL;下游引物 0· 25 μ L ;pfu buffer 1. 0 μ L ;pfu 酶 0· 1 μ L ;dNTP 0· 75 μ L ;ddH20 补足至 10 μ L。PCR 扩 增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0252] PCR反应条件：先94°C预变性10分钟；再94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延 伸1分20秒，30次循环；然后72°C后延伸10分钟。
[0253] 结果显示以cobGF/cobGR为引物时，PCR产物中有且只有一条987bps大小的条带， 即验证了包含基因 CobG的pVB12质粒的存在。以hemlF/hemlR为验证引物，PCR产物中有 且只有一条1647bps大小的条带，即验证了包含基因 heml的pLTTC405质粒的存在。这说 明重组表达载体PVB12和pLTTC405被成功转入到菌中。
[0254] 将上述鉴定阳性的重组菌B命名为R denitrificans (pVB12, pLTTC405)。
[0255] 实施例4、用重组工程菌B生产维生素 B12
[0256] 1、重组工程菌B的发酵培养
[0257] 重组工程菌 B P. denitrificans(pVB12，pLTTC405)用工业发酵培养基，在 37°C， 200印111过夜（1211)培养；然后按5%接种量^八），接种至5〇1^维生素812工业发酵培养 基（溶剂为水，溶质及其浓度为：玉米浆（干物）l〇g/L，甜菜碱25g/L，磷酸氢二铵0. 5g/L， 蔗糖80g/L，硫酸铵1. Og/L，尿素0. 5g/L，七水硫酸镁1. 75g/L，1%七水硫酸锌溶液7mL/ L，1 %六水氯化钴溶液12mL/L，1 % 5, 6-DMB溶液9mL/L ;pH 7. 3-7. 4)中，至其初始浓度为 0D600为0. 1，37°C，250rpm(旋转半径为50mm)，摇瓶培养168小时，得到发酵液。每个菌种 设置三组平行。
[0258] 2、发酵产物的检测
[0259] 运用液相色谱仪（LC，LC-2013, SHIMADZU)对步骤一发酵培养过的重组菌中聚合 物进行初步定性和定量分析。
[0260] 1)、工作原理
[0261] 被检测样品中不同形式的VB12在强光（1000-1500LUX)照射下转化为亚硫酸钴 胺，经过高效液相色谱柱分离，所得吸收峰面积与VB12标样峰成正比
[0262] 2)、液相样品准备：
[0263] 摇匀发酵液后立即用移液管量取25. 0ml发酵液至50ml的量瓶中，向其中加入 2. 0ml 8%的偏重亚硫酸钠水溶液和2. 0ml冰乙酸，摇匀后于90°C下水浴30分钟；冷却后 再向其中加入2. 0ml 8%的偏重亚硫酸钠水溶液，以水定容至刻度，摇匀后使用滤纸过滤， 取续滤液约20ml至直径小于10mm的无色透明玻璃试管中，于照度15000~20000LUX下光 照30分钟待用，取20微升注入高效液相色谱仪。
[0264] 3)、液相检测维生素 B12的方法：
[0265] 流动相--0· 05mol/L的磷酸二氢钾溶液：乙腈=83:17 ;pH为3. 5。
[0266] 流速为 1. OmL/min。
[0267] 检测波长：550nm。
[0268] 色谱柱：迪马-0DS-3, inersil，4. 6X250mm。
[0269] 4)、标准样品准备：
[0270] 精密称定已知含量和水分的氰钴胺对照品适量，以水制成浓度约为100 μ g/mL的 溶液。取20微升注入高效液相色谱仪，记录色谱峰的面积。
[0271] 5)、计算公式
[0272] C样品=A样品*C标样*稀释倍数/A标样* 1 · 1
[0273] C样品-样品中维生素 B12的浓度（ug/ml)
[0274] Cs#-氰钴胺标准品溶液的浓度（ug/ml)
[0275] As# -标准品液相色谱峰面积
[0276] A -样品中亚硫酸钴胺色谱峰面积
[0277] 因为测定使用的标样为氰钴胺,而检测的位置为亚硫酸钴胺，1. 1为实验的校正因 子。
[0278] 6)、结果显示：
[0279] 发酵液中的腺苷维生素 B12与8%的偏重亚硫酸钠水溶液在光照反应下会生成较 稳定的亚硫钴维生素 B12,在液相检测中，发现在亚硫钴出峰的位置检测到了有峰出现。重 组菌B P. denitrificans(pVB12，pLTTC405)中维生素 B12(计算的是亚硫钴维生素 B12)的 含量（58. 6mg/L)相比野生型P. denitrificans有很大的提高，具体结果见图3。
[0280] 之前的专利经报道（F. Blanche, B. Cameron, J. Crouzet, et al. Rh0ne ~Poulenc Biochimie. Eur atent, 0516647B1,1998)通过过表达以质粒作为 载体过表达cobF-cobM基因簇可以将脱氧假单胞菌的产量提高30 %，将重组菌 P. denitrificans (pVB12, pLTTC405)与专利报道的表达cobF-cobM基因簇的菌株进行比较 发现重组菌 P. denitrificans (pVB12, pLTTC405)中的 VB12 产量提高 2 倍。
[0281] 实施例5、多种重组工程菌（pVB12，pLTTC402/pLTTC405)的构建
[0282] 采用如实施例1中的方法，将实施例1步骤一构建的重组表达载体 pVB12, pLTTC402/pLTTC405用化学转化法或电转化方法分别转入到假单胞菌（Pseudomonas spp·)、嗜盐单胞菌（Halomonas spp·)、罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha)、气生单胞菌 (Aeromonas spp·)、粘着剑菌（Ensifer spp.)等，对于基因组