载体，命名为pUKBCDAI。
[0150] 2、E. coli BL21DE3 基因组上 T7RNA 聚合酶突变体 E. coli BL21DE3M 的构建
[0151] 将上述一构建成功的重组表达载体pVB12和pLTTC402转入宿主菌E. coli BL21DE3时，发现由于蛋白表达压力的原因，导致细胞不能在含有氨苄和氯霉的抗生素平板 上生长。
[0152] 因此为了降低细胞内蛋白的表达活力，将E. coli BL21DE3基因组上T7RNA聚合酶 进行了一个氨基酸的点突变（756R变为756S，突变前的酶的核苷酸序列为序列表中序列4， 将序列4自5'末端第2766位核苷酸C突变为A。）。突变方法为利用带有一个突变位点的 寡聚核苷酸进行同源重组，利用双抗平板上的生长表型作为筛选标记筛选突变体。
[0153] 进行突变的寡聚核苷酸序列为：
[0154] tattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttcagcttacagcctaccattaacaccaacaa agatagcgaga
[0155] 具体方法为：
[0156] 1)将辅助质粒pKD46RecA(该质粒为克隆载体，记载于"Datsenko KA，Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products. PNAS，2000, 97:6640-6645. "一文中，公众可从清华大学获得）。可提高寡聚核苷 酸的重组效率）转入到大肠杆菌E. coli BL21DE3中；
[0157] 2)将E. coli BL21DE3(pKD46RecA)制备感受态，将突变用的80bp寡聚核苷酸转入 到感受态中，进行基因组上的突变；
[0158] 3)将得到的重组菌进行培养3-4代，培养过程中不加抗生素，目的是使之前转入 的质粒pKD46RecA逐渐丢失；
[0159] 4)将丢失质粒的重组菌重新制作感受态，并且转入质粒pVB12和pLTTC402,在双 抗平板上进行筛选；
[0160] 5)对双抗平板上长出的阳性克隆进行测序验证，看其基因组上的T7RNA聚合酶是 否发生突变。
[0161] 通过上面所述步骤，成功得到了大肠杆菌突变体E.coli BL21DE3M，E.coli BL21DE3M为将大肠杆菌E. coli BL21DE3基因组上T7RNA聚合酶的第756位的R突变变为 S，具体将序列4自5'末端第2766位核苷酸C突变为A，序列4为T7RNA聚合酶编码基因。
[0162] 3、工程菌 E. coli BL21DE3MBCDAI 的获得
[0163] 工程菌 E. coli BL21DE3MBCDAI 为将 hemB，hemC, hemD, cobA, cobl 这 5 个基因 通过上述1获得的重组整合质粒pUKBCDAI导入上述2获得的大肠杆菌突变体E. coli BL21DE3M，并整合到该突变体基因组上，得到的重组菌，
[0164] 整合的方法为 FRT重组方法（One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products. PNAS, 2000, 97:6640-6645.)
[0165] 具体如下：
[0166] 1). E. coli BL21DE3MFRT 的构建
[0167] FRT重组方法要求基因组上和质粒上均含有一个FRT重组序列，因此需要将大肠 杆菌的基因组上插入一个FRT重组序列，插入位点为大肠杆菌基因组上的glpX位点。具体 方法为：
[0168] A.将E. coli BL21DE3M制作原始菌感受态，转入质粒pKD46(温度敏感型，30度培 养）；Amp培养基筛选；
[0169] B. PCR同源片段扩增：以pKD13 (该质粒为克隆载体，记载于"Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products. PNAS, 2000, 97:6640-6645. " 一文中，公众可从清华大学获得）为模板，使用引物 FRTF和FRTR为引物扩增得到重组PCR片段；
[0170] FRTF:ACGCGCGATGGCGTGGGAAGAACACGACGAATAATGTAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
[0171] FRTR:CAGTCCCGAAGGACTGGAAGGCTCAATCGATCAAATCAACTGTCAAACATGAGAATTAA
[0172] C.将E. coli BL21DE3M(pKD46)感受态制备，50ul的感受态细胞转入10-100ng PCR产物。电转条件：使用BioRad的电转仪，1mm电击杯，1.8kV放电，放电时间4-5秒。转 化细胞全部涂卡那抗性平板（浓度25ug/L);-般能长出10-20个克隆；
[0173] D.挑取多个单克隆（尽量选择大克隆），点Kan抗性平板保存，同时做菌落PCR验 证，验证引物为FRTP1F和FRTP1R
[0174] E. FRTP1F:CGCTGGAGTCTATTGCTTATC
[0175] F. FRTP1R:GGACGGTGACCAGGTAAAAC
[0176] G.得到单一的一条1. 4kb的DNA条带的即为阳性克隆；
[0177] H. 37度，无抗培养基液体培养过夜（丢失质粒pKD46);
[0178] I.制作感受态，电转化质粒pCP20,涂Amp培养基，30度培养；
[0179] J.挑取单克隆，点无抗性平板，Amp负筛，Kan负筛；
[0180] K. PCR验证，PCR引物仍为FRTP1F和FRTP1R得到单一的一条124bp的DNA条带的 即为阳性克隆E. coli BL21DE3MFRT。
[0181] 2). Ε· coli BL21DE3MBCDAI 的构建
[0182] 将E. coli BL21DE3MFRT制作原始菌感受态，电转化质粒pCP20,涂Amp培养基，30 度培养.将培养得到的菌株E. coli BL21DE3MFRT(pCP20)制备感受态，电转入上述1获得 的整合质粒PUKBCDAI，涂卡那平板，37度培养24小时，挑取单克隆进行PCR验证，PCR验证 的引物如下表8。
[0183] 表 8· E. coli BL21DE3MBCDAI 构建所需引物
[0184]
[0185] 能够得到5条单一的975, 945, 789, 843和738bp条带的即为阳性克隆目的菌 E.coli BL21DE3MBCDAI。
[0186] 四、重组菌 A E. coli BL21DE3MBCDAI(pVB12，pLTTC402)的构建及鉴定
[0187] 1).重组工程菌的转化
[0188] 将步骤一构建的重组表达载体pVB12和步骤二构建的重组表达载体pLTTC402 (两 种质粒的摩尔比为1 :1)用化学转化法转入到上述三构建的目的菌E. coliBL21DE3MBCDAI 中，得到重组菌A。
[0189] 2).重组工程菌的分子鉴定
[0190] 重组菌A涂布于LB-Amp-Cm的固体培养平板上，在37 °C静置培养48小时，挑取在 固体平板上长出的单克隆接种到LB-Amp-Cm液体培养基中，在37°C、200rpm下摇床培养12 小时，得到重组菌A菌液，提取质粒，采用PCR进行分子鉴定。以提取质粒为模板，以cobGF/ cobGR和hemlF/hemlR为验证引物。
[0191] cobGF :5,-ATGACCGACCTGATGACCT-3,；
[0192] cobGR :5,-CTAACCCTGTTCGAACGCC-3,；
[0193] hemlF: 5 ' -ATGCAGCGTTCTATCTT-3 ' ；
[0194] hemlR:5, -TTACTGTTTGATACCAG-3'
[0195] PCR反应体系（10yL体系）：质粒DNA 0.2yL;上游引物0.25yL;下游引物 0· 25 μ L ;pfu buffer 1. 0 μ L ;pfu 酶 0· 1 μ L ;dNTP 0· 75 μ L ;ddH20 补足至 10 μ L。PCR 扩 增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0196] PCR反应条件：先94°C预变性10分钟；再94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延 伸1分20秒，30次循环；然后72°C后延伸10分钟。
[0197] 结果显示以cobGF/cobGR为引物时，PCR产物中有且只有一条987bps大小的条带， 即验证了包含基因 CobG的pVB12质粒的存在。以hemlF/hemlR为验证引物，PCR产物中有 且只有一条1647bps大小的条带，即验证了包含基因 heml的pLTTC402质粒的存在。
[0198] 这说明重组表达载体pVB12和pLTTC402被成功转入到菌中。
[0199] 将上述鉴定阳性的重组菌A命名为E. coli BL21DE3MBCDAI (pVB12, pLTTC402)
[0200] 实施例2、重组工程菌A生产维生素 B12的卟啉前体物质
[0201] 1、重组工程菌的发酵培养
[0202] 将实施例 1 制备的重组工程菌 A E. coli BL21DE3MBCDAI (pVB12, pLTTC402)用 LB 培养基，在37°C，200rpm过夜（12h)培养；然后按5%接种量（v/v)，接种至50mL LBG维生素 B12发酵培养基（溶剂为水，溶质及其浓度为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/ L，蔗糖80g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1 %六水氯化钴溶液12mL/L，1 % 5, 6-DMB溶液 9mL/L;pH 7. 3-7. 4)中，至其初始浓度0D600为0. 1，37°〇，250印111(旋转半径为50臟)，摇瓶 培养168小时，收集发酵液。每个菌种设置三组平行。
[0203] 2、发酵产物的检测
[0204] 运用液相色谱仪（LC，LC-2013, SHIMADZU)对步骤一发酵培养过的重组菌中聚合 物进行初步定性和定量分析。
[0205] 1)、工作原理
[0206] 被检测样品中不同形式的VB12在强光（1000-1500LUX)照射下转化为亚硫酸钴 胺，经过高效液相色谱柱分离，所得吸收峰面积与VB12标样峰成正比
[0207] 2)、液相样品准备：
[0208] 摇匀发酵液后立即用移液管量取25. 0ml发酵液至50ml的量瓶中，向其中加入 2. 0ml 8%的偏重亚硫酸钠水溶液和2. 0ml冰乙酸，摇匀后于90°C下水浴30分钟；冷却后 再向其中加入2. 0ml 8%的偏重亚硫酸钠水溶液，以水定容至刻度，摇匀后使用滤纸过滤， 取续滤液约20ml至直径小于10mm的无色透明玻璃试管中，于照度15000~20000LUX下光 照30分钟待用，取20微升注入高效液相色谱仪。
[0209] 3)、液相检测维生素 B12的方法：
[0210] 流动相--0· 05mol/L的磷酸二氢钾溶液：乙腈=83:17 ;pH为3. 5。
[0211] 流速为 1. OmL/min。
[0212] 检测波长：550nm。
[0213] 色谱柱：迪马-0DS-3, inersil，4. 6X250mm。
[0214] 4)、标准样品准备：
[0215] 精密称定已知含量和水分的氰钴胺对照品适量，以水制成浓度约为100 μ g/mL的 溶液。取20微升注入高效液相色谱仪，记录色谱峰的面积。
[0216] 5)、计算公式
[0217] C样品=A样品*C标样*稀释倍数/