obG基因）、前咕啉3B甲基转移酶的编码基因（cobj基因）、前咕啉4 甲基转移酶的编码基因（cobM基因）、前咕啉6A合成酶的编码基因（cobF基因）、前咕啉 6A还原酶的编码基因（cobK基因）、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因（cobL基因）、前咕 啉8X甲基异位酶的编码基因（cobH基因）、钴啉酸a，c_二酰胺合成酶的编码基因（cobB基 因）、钴离子螯合酶的编码基因（cobNST基因）、二价钴啉酸a，c-二酰胺还原酶的编码基因 (cobR基因）是以表达载体甲的形式导入所述宿主菌中的。
[0052] 5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因（heml基因）是以表达载体乙的形式导入所述 宿主菌中的。所述基因5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因（heml基因）和T7RNA聚合酶 的编码基因（T7RNP基因）是以重组表达载体丙的形式导入宿主菌。
[0053] 进一步，表达载体甲为表达所述cobG基因、所述cobj基因、所述cobM基因、所述 cobF基因、所述cobK基因、所述cobL基因、所述cobH基因、所述cobB基因、所述cobNST基 因和所述cobR基因的载体（pVB12载体）。所述表达载体乙为表达所述heml基因的载体 (PLTTC402)。所述表达载体丙为表达所述heml和T7RNP基因的载体（pLTTC405)
[0054] 进一步，在重组菌A的制备方法中，宿主菌E. coli BL21DE3基因组上的T7RNA聚 合酶进行了一次点突变，将第756位氨基酸R突变成K，因此重组菌A的制备过程中宿主菌 为 E.coli BL21DE3M.
[0055] pUC19:为商用克隆载体，可从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购得，产品目 录为 MVV002。
[0056] pET28a :为商用克隆载体，可从北京鹏林生物技术有限责任公司购得，产品目录为 65258。
[0057] pEasy-Blunt :为商用克隆载体，可从北京全式金生物技术有限公司购得，产品目 录分别为CB111-02。
[0058] pCP20 质粒：该质粒为克隆载体，记载于"Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products. PNAS, 2000, 97:6640-6645. " 一文中，公众可从清华大学获得。
[0059] pKD46RecA质粒：该质粒上为克隆载体，记载于"Li ZJ, Shi ZY, Jian J, Guo YY, ffu Q, Chen GQ. Production of poly (3-hydroxybutyrate-c〇-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metab Eng, 2010 :352-359. " 一文中，公众可从清华大学获得。
[0060] pUK-质粒：该质粒为克隆质粒，记载于"Shi ZY(2012)Parallel DNA Assembly by Recombination. PhD thesis (University of Melbourne, Melbourne)，' 一文中，公众可从清 华大学获得。
[0061] pCDG质粒：载体全序列如序列表中序列6所示，公众可从清华大学获得。
[0062] pUKFRT质粒：载体全序列如序列表中序列7所示，公众可从清华大学获得。
[0063] 大肠杆菌E. coli BL21DE3 :中国全式金公司产品，产品目录号为CD601-01。
[0064] 脱氮假单胞菌（P. denitrificans):中国石家庄制药厂赠予。
[0065] 所用限制性内切酶购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博 迈德科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照 产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
[0066] 培养基配方：
[0067] (1)种子摇瓶培养基
[0068] LB培养基：5g/L酵母提取物（购自英国0XID公司，产品目录号LP0021)，10g/ L蛋白胨（购自英国0XID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为水。调pH值至 7.0-7. 2,高压蒸汽灭菌。
[0069] (2) LB维生素 B12发酵摇瓶培养基
[0070] LB维生素 B12发酵培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，鹿糖 80g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1 %六水氯化钴溶液12mL/L，1 % 5, 6-DMB溶液9mL/L ; pH 7. 3-7. 4。
[0071] (3)工业发酵摇瓶培养基
[0072] 玉米浆（干物）10g/L，甜菜碱25g/L，磷酸氢二铵0· 5g/L，蔗糖80g/L，硫酸铵 1. 0g/L，尿素0. 5g/L，七水硫酸镁1. 75g/L，1%七水硫酸锌溶液7ml/L，1%六水氯化钴溶液 12mL/L, 1% 5, 6-DMB 溶液 9mL/L ;pH 7. 3-7. 4。
[0073] 在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳 定性，如100 μ g/mL氨节青霉素，34 μ g/mL氯霉素。
[0074] 实施例1、提高维生素 B12产量的重组菌A的制备
[0075] 一、重组表达载体pVB12、pLTTC402和pUKBCDAI的构建
[0076] 1、重组表达载体pVB12的构建
[0077] 重组表达载体pVB12为将序列表中序列1所示的DNA分子与穿梭载体pRS424同 源重组，得到的重组载体；其中同源重组上游同源臂为序列1自5'末端第1-19位核苷酸， 同源重组下游同源臂为序列1自5'末端第17565-17604位核苷酸，
[0078] 序列表中序列1所示的DNA分子包括T7启动子、gltA启动子和如下12个基因： cobG基因、cobj基因、cobM基因、cobF基因、cobK基因、cobL基因、cobH基因、cobB基因、 cobN基因、cobS基因、cobT基因和cobR基因，其中T7启动子为序列表中序列1自5'末端 第45-64位核苷酸，gltA启动子为序列表中序列1自5'末端第6196-6903位核苷酸，cobG 基因为序列表中序列1自5'末端第94-1475位核苷酸，cobj基因为序列表中序列1自5' 末端第3319-4083位核苷酸，cobM基因为序列表中序列1自5'末端第5370-6131位核苷 酸，cobF基因为序列表中序列1自5'末端第1496-2281位核苷酸，cobK基因为序列表中序 列1自5'末端第2304-3047位核苷酸，cobL基因为序列表中序列1自5'末端第4106-5347 位核苷酸，cobH基因为序列表中序列1自5'末端第8516-9148位核苷酸，cobB基因为序 列表中序列1自5'末端第7189-8493位核苷酸，cobN基因为序列表中序列1自5'末端第 9169-12996位核苷酸，cobS基因为序列表中序列1自5'末端第14048-15046位核苷酸， cobT基因为序列表中序列1自5'末端第15094-16989位核苷酸，cobR基因为序列表中序 列1自5'末端第17038-17559位核苷酸。
[0079] 具体构建过程如下：
[0080] 1)、12个基因的密码子优化和合成
[0081] 在NCBI网站上提取12个基因的基因序列，这些基因的NCBI gene ID分 别是 cobG(GI:151172)、 cobj(GI:151175)、 cobM(GI:151178)、 cobF(GI:151171)、 cobK(GI:151176)、 cobL(GI:151177)、 cobH(GI:151173)、 cobB(GI:151147)、 cobNST (GI: 151154,151168, 151169)、cobR (GI: 1196420).然后用常用密码子优化网站 Opitimizer(http://genomes. urv. es/0PTIMIZER)根据大肠杆菌的密码子偏好进行了核苷 酸序列优化，优化后得到的序列可见序列表中8-19.在优化后的基因序列前添加核糖体结 合序列进行修饰（AGGAGGTAAAAAA，这12个基因的核糖体结合序列都位于质粒上，并没有插 入到基因组上）最后得到的序列送往上海青蓝公司进行合成，每单个基因合成在青蓝公司 的通用载体PUC57上。
[0082] 2)、克隆载体pUC19GFK的构建
[0083] 以合成的质粒pUC57cobG，pUC57cobF和pUC57cobK为模板，使用下表1中的引物， 用phusion酶进行PCR反应扩增目的基因 cobG, cobF和cobK,并在引物两端设计引物酶 切位点Drain.以pUC19(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录为MVV002,构 建过程中PCR引物上引入T7启动子）为模板，使用下表中的pUC19F和pUC19R为引物，用 phusion酶进行PCR反应扩增载体骨架pUC19,并在一侧引入T7启动子和酶切位点Drain. 构建过程中所用引物如表1所示。
[0084] 表1为克隆载体pUC19GFK的构建引物
[0085]
[0086] 上表中单下划线标注的是酶切位点，双下划线标注的是T7启动子序列。
[0087] PCR反应体系（20yL体系）：模版DNA 0.4yL;上游引物0.5yL;下游引物 0.5yL;pfu buffer 2.0yL;phusion 酶 0.2yL;dNTP 1.5yL;ddH20补足至 20yL。PCR 扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0088] PCR反应条件：先98°C预变性5min ;再98°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸 lKb/30sec，30次循环；然后72°C后延伸10分钟。
[0089] 用Dralll酶切上述PCR反应得到的cobG，cobF，cobK和pUC19骨架片段，得到酶 切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌 E. coli Transl-Tl中，得到转化子，提取转化子的质粒，测序，结果为cobG, cobF, cobK 3个 基因成功的连接到了克隆载体PUC19上，得到重组载体pUC19GFK。
[0090] 经过测序，重组载体PUC19GFK为将序列1自5'末端第81-3047位核苷酸（为含 有cobG基因、cobF基因、cobK基因的DNA片段）插入克隆载体pUC19的Drain酶切位点 得到的载体。
[0091] 3)克隆载体pUKJLM的构建
[0092] 以合成的质粒pUC57cobJ，pUC57cobL和pUC57cobM为模板，使用下表2中的引物， 用phusion酶进行PCR反应扩增目的基因 cobL, cobL和cobM并在引物两端设计引物酶切 位点Drain.以pUK为模板，使用下表中的pUKF和pUCKR为引物，用phusion酶进行PCR 反应扩增载体骨架PUC19,并在一侧引入T7启动子和酶切位点Drain.构建过程所用的引 物均列在表2中。
[0093] 表2为克隆载体pUKJLM构建所需引物
[0094]
[0095] 上表中单下划线标注的是酶切位点，双下划线标注的是T7启动子序列。
[0096] PCR反应体系（20yL体系）：模版DNA 0.4yL;上游引物0.5yL;下游引物 0.5yL;pfu buffer 2.0yL;phusion 酶 0.2yL;dNTP 1.5yL;ddH20补足至 20yL。PCR 扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
[0097] PCR反应条件：先98°C预变性5min ;再98°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸 lKb/30sec，30次循环；然后72°C后延伸10分钟。
[0098] 用Dralll酶切上述PCR反应得到的