孔板。 同样量的重组纯化的IL-7制备物被保温在外源凝集素包被的微孔板孔中。在该步骤中，根 据给定的外源凝集素与IL-7的聚糖修饰的亲和性，不同量的IL-7与外源凝集素保持结合。 通过与生物素连接的IL-7特异性抗体保温来进行显示。外源凝集素-IL-7-抗体三明治用链 亲和素-过氧化物酶共辄物来显示。
[0365] 使用了 8种不同的外源凝集素对IL-7纯化样品进行了定性。每种外源凝集素特异 性识别糖基团。聚糖基元和结构特异性被显示在表6中。
[0366] 表6:被外源凝集素识别的糖基团的模式概述和它们的聚糖基元和结构特异性的 清单。
[0367] LEA是来自番前（Lycopersicon esculentum)的外源凝集素，
[0368] WGA来自小麦（Triticum vulgare)，
[0369] UEA. I来自 Ulex europeus,
[0370] MAA来自Maackia amurensis，
[0371] ACA来自尾糖苋(Amaranthus caudatus)，
[0372] AIA来自Artocarpus intergrifolia,
[0373] ABA来自双抱蘑^(Agaricus bisporus)，
[0374] PHA.L来自菜豆（Phaseolus vulgaris) ·
[0375] 表6:
[0376]
[0377] 结果显示在图12中。
[0378]外源凝集素清楚地证实了不同的亲和性，提供了溶液中的纯化IL-7蛋白的可获取 的聚糖装饰的通用结构的信息。
[0379] 因此，ACA、ABA和AIA对Gal和GalNAc具有亲和性。所有三种外源凝集素的阳性反应 表明了带有这些单糖的N-和0-聚糖结构的存在。用ΑΒΑ获得的特异性信号表明了 0-聚糖结 构的存在。ACA与ΑΙΑ相比以及在较小程度上与ΑΒΑ相比有较弱的信号。这表明0-聚糖被扩 增，仅有很少的GalNAc作为末端残基。
[0380] LEA对GalNAc具有亲和性，表明了N-聚糖结构的存在。在试验的GlcNAc-特异性外 源凝集素中（数据未显示），只有对N-乙酰乳糖胺具有亲和性的那些显示出阳性信号。
[0381] 由于与N-连接的聚糖的核心结构具有低的结合亲和性，WGA显示出弱的信号。高度 复杂的N-聚糖屏蔽了核心结构，使得外源凝集素的亲和性难以操作。
[0382] UEA.I对于分支果糖的存在具有特异性活性。结合相当弱，表明N-聚糖不完全的但 是有效的果糖基化。
[0383] MAA对末端唾液酸具有亲和性。MAA信号强烈，表明在N和0-聚糖上都有效地唾液酸 化。
[0384] PHA.L对N-聚糖的复杂分支结构具有亲和性并显示出强的信号，证实了 MAA的结 果。PHA-L信号表明大的三或四天线N-聚糖的存在。
[0385]在CH0来源的h IL-7 (在可用时)上定性的大多数典型的哺乳动物0-聚糖：
[0386]
[0387] 总的来看，这些分析表明使用的基于CH0细胞的表达系统产生了人类IL-7复杂的 (三天线)N-连接寡糖，如同在下面的图中描述的那样，在它们的位于70、91和116位的ASN残 基处形成分支，具有高度的部分到完全唾液酸化，最多达10个唾液酸残基。此外，CH0来源的 IL-7在T110位上含有0-聚糖。
[0388] 因此，尽管带有复杂的唾液酸化的N-聚糖和0-聚糖，IL-7纯化的批次产品仍然含 有完全和部分糖基化蛋白的混合物。
[0389] 实施例F:药物物质到药物产品：重组CH0细胞表达的hIL-7的配方、储存和长期稳 定性。
[0390] 药物物质的最佳配方的搜索通过组合基质研究进行，以评估不同的胁迫条件(温 度、缓冲液、PH、张力调节剂浓度、搅拌、强烈照明）对纯化的蛋白的长期稳定性的影响。
[0391] 高度复杂的纯化重组人类IL-7被显示在乙酸和琥珀酸缓冲液中，在5到50mM的浓 度范围内是稳定的。适当的pH从pH=5.0到7.0之间选择，理想的储存温度在-20°C到+4°C之 间。
[0392] 糖和低浓度表面活性剂(聚山梨酸酯聚合物)可以被添加到制备物中以防止非共 价的可溶性聚集。
[0393] 在这样的条件下，IL-7可以在+4°C (以液体形式）下，浓度范围从0.5到8 .Omg/ml， 优选从2.0到4. Omg/ml，储存超过12个月。液体形式的药物组合物具有改进的稳定性分布情 况。
[0394] 实施例G.哺乳动物细胞来源的重组人类IL-7在特异性生物学分析中的增殖活性 分析
[0395] 哺乳动物细胞来源的重组人类IL-7的生物学活性在特异性生物分析中被评估，使 用来自CBA/C57BL小鼠的骨髓细胞衍生的鼠类前B细胞株ro-l(German Cell Bank DSMZ， Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen)，它的生长严格依赖于IL-7 (Mire-Sluis et al.；2000；J. Immunol .Methods; 236:71-76)。这些细胞被维持在商业化的 含有IL-7的培养基中进行培养，在进行生物分析之前实行IL-7饥饿。
[0396] 生物分析用被测试的IL-7样品进行，平行地使用已知的大肠杆菌来源的IL-7阳性 对照和缺乏IL-7的阴性对照。
[0397] 来自对照或样品的IL-7被加入到饥饿的细胞培养物中，诱导剂量依赖性的细胞增 殖的重新起始，在此期间放射性标记的胸腺啼啶(3H-Tdr，Amersham)被分裂的细胞摄入。标 记的量是跳动的，在液闪β计数器(Wallack)中测量，单位为每分钟的计数(cpm)。
[0398] 此外，生物分析也可以使用反映细胞的整体代谢的染料标记物、例如MTT染料（3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑，被线粒体氧化还原活性所还原）或MTS染料(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-( 3-羧甲基氧基苯基)-2-( 4-磺苯基)-2H-四唑)来进行。
[0399] 阳性对照和被测试样品的连续稀释允许使用cpm数量相对于被测试的样品/对照 的量进行作图。
[0400] 图13显示了典型的生物学分析测试中常规获得的剂量反应性动力学数据和曲线： PB-1细胞的生长被未糖基化的r-hIL-7(在大肠杆菌中表达)或高度糖基化的r-hIL-7(在哺 乳动物细胞中生产)所诱导。（数据点表示三次测定的平均值±SD)。
[0401] 图14显示了典型的生物学分析测试中常规获得的剂量反应性动力学数据和曲线： PB-1细胞的生长被未糖基化的r-hIL-7(在大肠杆菌中表达）、高度糖基化或超糖基化的r-hIL-7 (在哺乳动物细胞中生产)所诱导。（数据点表示三次测定的平均值± SD)。
[0402]对于每个样品来说被考虑的重要参数是ED50,即给出最大活性的一半时的浓度 (ng/ml)。较高的ED50意味着较低的活性。
[0403] IL-7批次之间的活性比较通过分析剂量反应曲线参数例如斜率系数、最大活性来 阐明。从所有曲线参数中，ED50浓度(单位为ng/ml)将参数的偏差合并在一起。ED50对应于 在体外诱导一半可能的最大诱导活性所必需的IL-7剂量。在这一点上，高生物活性的分子 对应于低Η)50值，而较高的ED50浓度典型地来自于体外生物活性较低的IL-7制备物。
[0404]然而，在本发明中，体外活性的差异并不必然代表同样的体内活性的差异。
[0405] 实施例Η.超糖基化的IL-7多肽在灵长类动物中免疫原性的体内评估
[0406] 在CH0细胞系中表达(实施例Α2、Α6和Β)并按照实施例D纯化的猿类超糖基化IL-7 (sIL-7)，在重复地在正常灵长类动物中使用sIL-7后，在体内评估潜在的免疫原性的出现。
[0407] 未经免疫的年轻成年Cynomolgus猴(Macaca fascicularis)(n = 4)被引入研究， 并以l〇〇yg/kg/注射的剂量水平接受超糖基化的sIL-7。被处理的动物在连续5周的时间中 接受总共6次IL-7的皮下注射。动物在两个月的期间接受临床观察。在研究过程中的不同的 时间点收集血液样本:在使用sIL-7前的第一天，在第37天和研究结束时。
[0408]所有的动物在研究中存活，对于s IL-7治疗没有负面反应。s 11 -7的使用是局部良 好耐受的。当在目的在于检测结合抗体的特异性ELISA中通过干涉进行测试时，在所有被处 理的动物的血清中没有检测到抗IL-7抗体。与此相比，大肠杆菌来源的重组IL-7尽管被生 产为高度纯化的药物产品，在同样的规程中将在血清中诱导高滴度的IL-7结合抗体的产 生，范围从1:400到1:5000。
[0409] 实施例1.超糖基化的IL-7多肽在灵长类中的体内生物学活性
[0410] 在CH0细胞系中表达(实施例A1、A6和B)并按照实施例D纯化的人类超糖基化IL-7 (hIL-7)，在体内进行评估以确定hIL-7在正常灵长类中的药物动力学和药效学情况。
[0411 ] 未经免疫的年轻成年Cynomolgus猴(Macaca fascicularis)被引入研究并分为两 组:未处理的n = 2，hIL-7 100yg/kg/注射n = 2。被处理的动物接受单次IL-7的皮下注射。动 物在45天的期间接受临床观察。在研究过程中的不同的时间点收集血液样本:在第1(注射 后0、3、6、9和 12小时）、2、3、4、7、21和 45 天。
[0412] hIL-7的使用具有良好的耐受性，在注射位点没有局部反应。在恒河猴中单次皮下 注射hIL-7后，从前72个小时建立了 hIL-7的药物动力学形式和参数：
[0413] ?血浆分布情况在峰值吸收之后显示出双指数递减。
[0414] ?在血浆中观察到的产物半衰期在30/40小时的范围内。该半衰期与在同样条件 下使用大肠杆菌来源的重组IL_8(5到8小时)观察到的半衰期相比有显著的增加。这反映出 血液中超糖基化的IL-7多肽的提高的体内稳定性。
[0415] ?平均存留时间(MRT)是40小时，比较而言大肠杆菌产物是大约10小时。
[0416] ?达到最大浓度的时间是180分钟。
[0417] 总的来说，药物动力学研究显示出本发明的超糖基化的IL-7多肽显示了改进的和 延长的药物动力学分布情况，这导致了改进的药效学效应。
[0418] 以100yg/kg单次注射hIL-7诱导了外周CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞数量的显著增 加，与基线预处理值相比分别改变了 200 %和170 %。外周血中表达特异性IL-7受体α链 (CD127)的淋巴细胞Τ细胞(CD4和CD8)的数量早在注射后6小时时就暂时减少。在注射后48 小时，外周血中表达⑶127的淋巴细胞Τ细胞重新出现，在注射后仅仅7天就返回到基线值。 在单次皮下注射大肠杆菌来源的重组IL-7之后，完全恢复表达CD127的淋巴细胞Τ细胞的基 线值在注射后4天发生。与大肠杆菌来源的重组IL-7相比，超糖基化的IL-7多肽的受体占有 率动力学更长，反映出正如下面所显示的超糖基化的IL-7多肽在灵长类动物中的较长的半 衰期。这些结果与以前的结果一致，显示出尽管IL-7的IV给药导致了较好的生物可用性，这 并没有转化成改进的药物动力学效应，事实上，通过皮下注射获得的延长的投送形式比通 过IV注射获得的急性投送形式更为有效。这里蛋白的超糖基化诱导了延长的动力学分布情 况，这转过来转化成改进的药效学活性。鉴于这种扩展的分布情况，也希望获得改进的临床 耐受性，因为药物的副作用通常与峰值浓度有关。
【主权项】
1. 纯化的哺乳动物超糖基化IL-7多肽，其中该超糖基化的IL-7多肽含有至少3个N-糖 基化氨基酸残基。2. 超糖基化的IL-7组合物，其中该组合物含有至少80%的在至少3个不同的氨基酸残 基上被N-糖基化的IL-7多肽。3. 权利要求2中的组合物，其中该组合物含有80 %到95 %之间的在至少3个不同的氨基 酸残基上被N-糖基化的IL-7多肽。4. 权利要求2或3中的超糖基化的IL-7组合物，含有至少80 %的IL-7多肽，该多肽在3个 到最多达8个不同的氨基酸残基上被糖基化、包括1个0-和最多达7个N-糖基化位点。5. 权利要求4中的组合物，其中该组合物含有80 %到95 %之间的IL-7多肽，该多肽在3 个到最多达8个不同的氨基酸残基上被糖基化、包括1个0-和最多达7个N-糖基化位点。6. 权利要求2到5任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中的IL-7多肽是人类IL-7多 肽。7. 权利要求2到6任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中的糖基化位点是在IL-7多肽 序列中天然存在和/或人工产生的。8. 权利要求2到7任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中的IL-7多肽是人类IL-7多 肽，以及其中的糖基化位点选自70、91和116位的Asn残基，110位的Thr，以及表1中和优选在 表2中列出的任何人工产生的糖基化位点，或其组合。9. 权利要求2到7任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中该IL-7多肽含有或富集选自 下面的N-连接的糖链： a) 哺乳动物类型的糖链，优选为CH0细胞表达的类型； b) 含有复杂的N-糖链(例如三天线或二天线结构）、更优选含有大量甘露糖和乙酰葡萄 糖胺分子和大量末端唾液酸残基的糖链； c) 被α-2，6-唾液酸转移酶或α-2，3-唾液酸转移酶唾液酸化的糖链;和/或 d) 显示出3到30个、优选7到23个唾液酸基-Ν-乙酰半乳糖胺的唾液酸化的糖链。10. 权利要求9中的超糖基化的IL-7组合物，其中该IL-7多肽还含有或还富集具有末端 唾液酸残基的0-连接的糖链。11. 权利要求9中的超糖基化的IL-7组合物，其中的糖链含有带有部分或完全末端唾液 酸化的四天线到二天线结构，更优选含有三或二唾液酸化的三天线结构，和/或带有二唾液 酸化的二天线结构。12. 权利要求2到11任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中该IL-7多肽的平均等电点 低于6.5，用质谱分析确定的平均表观分子量大于25KDa，或用SDS凝胶电泳确定的平均分子 量大于27Kda。13. 权利要求2到12任何一个中的超糖基化IL-7组合物，其中该IL-7超糖基化多肽显示 在哺乳动物宿主中延长的体内半衰期和平均存留时间。14. 具有修饰的氨基酸序列的IL-7多肽，其中该序列含有至少1个人工产生的糖基化位 点。15. 权利要求14中的多肽，其中该多肽含有1、2、3或4个，更优选1、2或3个，甚至更优选1 或2个人工产生的糖基化位点。16. 权利要求14或15中的多肽，其中该多肽含有的人类IL-7多肽的序列含有选自下面 的一个或几个氨基酸修饰:Lys28Asn-Ile30Ser-Ile30Thr-Ile30Asn-Ser32Thr-Leu35Ser-Leu35Thr-Glu38Ser-Glu38Thr-Phe39Ser-Phe39Thr-Phe42Ser-Phe42Thr-Glu52Ser-Glu52Thr-Val82Asn-Glu84Thr-Glu84Ser-Lys97Asn-Arg99Thr-Arg99Ser-Alal02Asn-Leul04Thr-Leul04Ser-Leul04Asn-Glul06Thr-Glul06Ser-Leul28Ser-Leul28Thr-Ilel45Asn-Metl47Thr-Metl47Ser-Metl47Asn-Thrl49Ser，或者含有至少 5 个氨基酸残基， 典型至少8、9、10、11、12或15个残基的其不同的片段。17. 为权利要求14-15任何一个中的IL-7多肽编码的核酸分子。18. 为含有SEQ ID NO: 19的多肽编码的核酸分子。19. 含有SEQ ID NO:2或4的序列或其互补链的核酸分子。20. 含有SEQ ID NO:6的序列的核酸分子。21. 含有权利要求17到20任何一个中的核酸分子的载体。22. 含有权利要求21中的载体的重组宿主或宿主细胞。23. 权利要求22中的重组宿主或宿主细胞，其中该宿主或宿主细胞天然地或在转基因 后表达或过量表达适合的糖基转移酶和/或唾液酸转移酶基因，优选为α-2-6唾液酸转移酶 基因。24. 生产在权利要求1到16任何一个中定义的IL-7多肽的方法，包括： a) 培养含有编码IL-7多肽的重组核酸分子的重组宿主细胞，和 b) 收集该细胞生产的IL-7多肽， 其中培养以补料分批或流加的方式进行，从而产生超糖基化的IL-7多肽。25. 含有权利要求2到16任何一个中的IL-7多肽组合物的药物物质，其中该药物物质含 有少于大约10%的未糖基化或单糖基化的IL-7多肽和/或基本上不含与产物有关的杂质。26. 与前面在权利要求1到16任何一个中定义的IL-7多肽具有特异性免疫反应的抗体， 及其片段或衍生物。27. 含有权利要求26中的抗体的药物组合物。28. 权利要求26中的抗体在生产用于治疗哺乳动物受试者中的淋巴增殖性紊乱或自身 免疫疾病的药物中的应用。29. 药物组合物，含有有效量的权利要求25中的药物物质和一种或多种药物可相容的 载体或赋形剂。30. 权利要求29中的药物组合物，其中该组合物每星期给药3次，每星期给药2次，每星 期给药1次，每两星期给药1次，每月给药1次，在疫苗接种之前或疫苗接种前后给药1次或2 次。31. 权利要求2到13任何一个中的超糖基化IL-7多肽组合物在生产用于在受试者中引 起或调节免疫反应的药物中的应用。32. 权利要求31中的应用，其中的药物用于诱导延长的淋巴细胞生成刺激和/或免疫反 应的放大。33. 权利要求31中的应用，其中的药物用于治疗病毒感染，例如HIV感染、病毒性肝炎、 西尼罗热、登革热。34. 权利要求33中的应用，其中的超糖基化IL-7多肽将与干扰素分子结合给药。35. 权利要求31中的应用，其中的药物用于在免疫受损的受试者中改进胸腺生成的恢 复。36. 权利要求35中的应用，其中超糖基化的IL-7多肽将与角质细胞生长因子、干细胞因 子、gonadostimulin诘抗剂或生长激素结合给药。37. 权利要求21中的应用，其中的超糖基化IL-7多肽将与抗原或抗原的混合物结合给 药，以提供针对恶性细胞、病毒或细菌的治疗性免疫作用。38. 权利要求37中的应用，其中超糖基化的IL-7多肽还将与GM-CSF结合给药。
【专利摘要】本发明的发明名称为“糖基化的IL-7，制备及应用”，属于生物制药领域，更具体来说属于白介素-7变体的药物应用领域。本发明涉及新的和改进的白介素-7多肽，以及含有它们的组合物、它们的制剂和应用。更具体来说，本发明涉及了具有改进的性质的超糖基化的IL-7多肽，以及它们的生产和治疗性应用。本发明还公开了具有修饰的氨基酸序列、含有人工产生的糖基化位点的新的IL-7多肽，以及相应的核酸分子、载体和重组宿主细胞。本发明还涉及了使用这样的多肽、细胞或核酸，用于治疗性或预防性治疗哺乳动物受试者，包括人类受试者。
【IPC分类】A61P31/12, A61K38/20, C07K16/24, A61K39/395, A61P37/02, C12N15/85, C07K14/54, C12N15/24
【公开号】CN105647939
【申请号】
【发明人】米歇尔·莫雷尔, 布里吉特·阿苏利纳, 依安娜·朗塞, 安娜·格雷瓜尔, 科里纳·布雷克
【申请人】叙塞理斯
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2006年7月19日