胎球蛋 白，这是一种唾液酸化的蛋白；2道:用唾液酸酶处理的胎球蛋白；道3:hIL-7;道4:用唾液酸 酶处理的hIL-7。
[0067] 图12:超糖基化的IL-7多肽的外源凝集素亲和性(ELISA筛选）。外源凝集素(来自 Lycopersicon esculentum的LEA，来自Triticum vulgare的WGA，来自Ulex europeus的 UEA. I，来自Maackia amurensis的MAA，来自 Amaranthus caudatus的ACA，来自 Artocarpus intergrifolia的AIA，来自Agaricus bisporus的ABA，来自Phaseolus vulgaris^PHA.L) 包被的平板被用于结合同样量的重组的纯化的hIL-7制备物。结合的IL-7的量依赖于外源 凝集素与聚糖基团的特异性，通过与生物素偶联的特异的抗hIL-7抗体(Ab)来显示。外源凝 集素-IL-7-Ab夹心结构用链亲和素-过氧化物酶结合物显示。
[0068] 图13:重组人类IL-7活性的生物分析。PB-1细胞生长的剂量反应性动力学被未糖 基化的r-hIL-7(在大肠杆菌中表达)或高度糖基化的r-hIL-7(在哺乳动物细胞中生产)所 诱导。
[0069] 图14:重组人类IL-7活性的生物分析。在典型的生物分析中常规地获得了剂量反 应性的动力学数据和曲线:PB-1细胞生长被未糖基化的r-hIL-7(在大肠杆菌中表达）、高度 糖基化的或超糖基化的r-hIL-7 (在哺乳动物细胞中生产)所诱导。（数据点代表三次测定的 平均值土 SD)。
[0070] 发明详述
[0071] 本发明涉及超糖基化的IL-7组合物、它们的生产以及在药物工业中的应用。本发 明第一次显示了依赖于多肽的糖基化情况，IL-7的活性和/或性质可以被增强。本发明还令 人吃惊地公开了，与体外数据相反，在体内，具有至少2个到优选3个被占据的N-连接的糖基 化位点和一个〇-连接的糖基化位点以及最大化的寡糖基团的末端唾液酸化的IL-7，可以获 得最好的活性。本发明还公开了人工产生的超糖基化的IL-7多肽，它表现出延长的活性(从 而允许减少的给药频率），和/或降低的长期免疫原性。至于IL-7的应用，这样的多肽和组合 物代表了高度有价值和有用的活性分子，可用于在受试者、包括人类受试者中调节免疫反 应。
[0072] 因此，本发明的第一个目标在于超糖基化的IL-7组合物。
[0073] 本发明的另一个目标涉及使用超糖基化的IL-7,用于制造由该超糖基化的IL-7和 至少一种可药用的载体或赋形剂组成的药物，以治疗哺乳动物受试者。
[0074] 本发明的另一个目标是在受试者中引起或刺激免疫反应的方法，包括给受试者使 用有效量的超糖基化的IL-7组合物。
[0075]本发明的另一个目标涉及使用超糖基化的（优选高度唾液酸化的）IL-7组合物，用 于制造在受试者中引起或刺激免疫反应的药物。
[0076] IL-7 多肽
[0077] 在本发明的上下文中，"IL-7多肽"是指哺乳动物(例如人类、猿、牛、马、猫或狗）的 IL-7多肽。更优选情况下，IL-7多肽是人类IL-7多肽，特别可用作治疗药物或疫苗。此外，特 别是用于非人类灵长动物实验或兽医应用中时，IL-7多肽可以是任何其它的哺乳动物IL-7 多肽，例如猿的IL-7多肽或狗的IL-7多肽。
[0078] 本发明的优选的人类IL-7多肽包含在EP 314 415或W02004/018681 A2中描述的 氨基酸序列，以及它们的任何天然变异体和类似物。人类IL-7的序列也可以从基因库中获 得。典型的野生型蛋白含有152个氨基酸，并且也可以含有另外的N-末端甲硫氨酸残基(SEQ ID N0:1)。更优选情况下，其变异体包括由天然多态性引起的天然的等位基因变异体，包括 SNPs、剪接变异体等。在具体的实施方案中，术语IL-7多肽是指具有SEQ ID N0:1的序列的 多肽或其天然变异体。
[0079]在另一个实施方案中，IL-7多肽是狗的IL-7多肽。在这一方面，本发明第一次公开 了分离的IL-7多肽的序列，这代表了本发明的另一个目标。具体来说，本发明涉及含有在 SEQ ID N0:7中描述的氨基酸序列的IL-7多肽，以及其任何天然变异体、类似物或独特的片 段。术语"变异体"或"类似物"是指与SEQ ID N0:7不同的多肽，具有一个或有限数量的氨基 酸缺失、置换或添加。优选情况下，这样的变异体或类似物显示出与SEQ ID N0:7具有大于 85%、优选大于90%、优选大于95%、最优选大于98%的一致性百分数。
[0080]在本发明中使用的IL-7多肽优选为重组的IL-7。本文中使用的术语"重组的"是指 多肽是从重组表达系统获得或衍生的，即来自被工程化而含有为IL-7多肽编码的核酸分子 的宿主细胞(例如微生物或昆虫或植物或哺乳动物）的培养物或转基因植物或动物。"微生 物的"是指在细菌表达系统中制造的重组蛋白。"哺乳动物的"是指在哺乳动物表达系统中 制造的重组糖蛋白。正如将在下面讨论的那样，所有这些宿主细胞优选将天然地或在转基 因后表达适合的糖基转移酶和/或唾液酸转移酶基因。IL-7多肽也可以通过在体外或体内 使用适当的糖基转移酶和/或唾液酸转移酶分子、或通过接枝寡糖结构来糖基化。
[0081 ] 人类IL-7多肽的一个具体例子是SEQ ID N0:1中的多肽，含有二硫桥Cys2-Cys92、 Cys34_Cysl29和Cys47_Cysl41。
[0082]本发明的IL-7多肽也可以含有成熟的IL-7多肽的序列，或者进一步含有其它的氨 基酸残基，例如分泌肽。这样的分泌肽的优选的例子包括但不限于从含有ΕΡ0信号肽、SEAP 信号肽、IgGK信号肽、乳转铁蛋白/玻璃粘连蛋白信号肽、VIP/玻璃粘连蛋白信号肽和 cytostatin bis信号肽的组中选择的信号肽。这些信号肽的系列分别显示在SEQ ID N0 13 到18中。在具体的实施方案中，信号肽是由发明人在从ΕΡ0和IL-7信号肽衍生的序列之间制 成的杂交体结构。该信号肽被命名为EPy7或EP7,其序列被显示在SEQ ID N0:19中，代表了 本发明的一个特定的目标。
[0083]超糖基化的IL-7和组合物
[0084]在本发明的上下文中，术语"超糖基化的IL-7"是指具有至少三个被占据的糖基化 位点、即具有至少三个糖基化的氨基酸残基的IL-7多肽。
[0085] "糖基化位点"是指多肽中被糖基化的、即与糖结构结合的任何氨基酸残基或区 域。这样的位点典型为N-糖基化位点（即多肽中任何允许通过N-连接与糖结构结合的氨基 酸残基或区域)和/或〇-糖基化位点（即多肽中任何允许通过〇-连接与糖结构结合的氨基酸 残基或区域）。糖基化位点的共有序列在本技术领域中是众所周知的。例如，共有的N-糖基 化位点典型具有下列结构:Asn-X-Ser/Thr，其中的X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。正如 将在下文中公开的那样，这样的糖基化位点可以天然存在于IL-7多肽序列中，和/或人工添 加或产生在该序列中。
[0086]术语"超糖基化的IL-7组合物"是指其中至少80%的IL-7多肽具有至少三个被占 据的糖基化位点、即具有至少三个糖基化的氨基酸残基的IL-7组合物。优选情况下，这样的 组合物含有至少80 %的IL-7多肽，它们在至少三个N-糖基化位点以及可选的一个0-糖基化 位点上被糖基化。最优选情况下，这样的组合物基本上不含未糖基化或单糖基化的IL-7多 肽，因此含有最多20 %的双糖基化的IL-7多肽。在优选实施方案中，超糖基化的IL-7组合物 是指其中至少90%的IL-7多肽在三个N-糖基化位点以及可选的一个0-糖基化位点上被糖 基化的IL-7组合物。最优选情况下，这样的组合物基本上不含未糖基化或单糖基化的IL-7 多肽，因此含有最多10%的带有或不带有单-0-糖基化的双-N-糖基化的IL-7多肽。
[0087] IL-7的一级氨基酸序列含有三个推测的N-糖基化位点，它们是70、91和116位(相 对于人类野生型序列而言，参见SEQ ID N0:1)上的天冬酰胺(Asn)残基。此外，本发明显示 出IL-7序列也含有一个0-糖基化位点，即110位上的苏氨酸(Thr)残基。在特定的实施方案 中，本发明的超糖基化的IL-7多肽是具有上述三个被占据的N-糖基化位点以及带有或不带 有一个被占据的〇-糖基化位点的IL-7多肽，超糖基化的IL-7组合物是其中至少80 %的IL-7 多肽在上述的N-糖基化位点和可选的也在0-糖基化位点被糖基化的IL-7组合物。
[0088]在具体的实施方案中，超糖基化的IL-7多肽可以含有其它人工添加或产生的糖基 化位点。因此，本发明的超糖基化的IL-7多肽是具有至少三个被占据的N-糖基化位点和一 个被占据的〇-糖基化位点的IL-7多肽，这些位点或者是天然发生的，也可以是/或人工添 加/产生的;超糖基化的IL-7组合物是其中至少80%的IL-7多肽在至少4个糖基化位点被糖 基化的IL-7组合物，这些位点或者是天然发生的，也可以是/或人工添加/产生的。
[0089]在这一方面，本发明现在公开了具有修饰的氨基酸序列的IL-7多肽，其中该序列 含有至少一个人工产生的糖基化位点。按照具体的实施方案，本发明的IL-7多肽包含1、2、3 或4个人工产生的糖基化位点，更优选1、2或3个、更优选1或2个糖基化位点。
[0090] 人工产生的糖基化位点优选为N-连接的糖基化位点。共有的N-糖基化位点典型具 有下面的结构:Asn-X-Ser/Thr，其中的X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。
[0091] 糖基化位点可以从装配的合成的寡聚核苷酸通过化学方法、或者使用几种技术包 括诱变方法以及下面的本技术领域中现有的技术在IL-7-级氨基酸序列中的不同位置产 生或添加。因为修饰的IL-7多肽将保留与IL-7受体结合的能力，糖基化位点最优选产生在 IL-7多肽序列的不改变IL-7与IL-7受体的结合能力的区域或结构域中。最优选情况下，位 点被导入到多肽的α螺旋之外，优选除了在甘氨酸残基的最邻近点之外。优选情况下，它们 被导入到最柔性的区域，避开更刚性和对多肽的三级结构重要的区域。优选情况下，糖基化 位点的产生不影响任何参与二硫键的半胱氨酸残基(例如Cys 2、34、47、92、129和141)，也 不影响任何参与IL-7多肽与其关联的受体的相互作用的关键残基（例如Ser 19、Leu 23和 77、Tyr 12、Val 15、Gln 22、Lys 81和Glu 84)，也不影响任何参与多肽活性的保守残基(例 如 Arg 133、Gln 136、Glu 137、Lys 139 和 144、Thr 140 和 Asn 143)。糖基化位点典型地通过 在对照IL-7多肽的一级序列中通过一个或几个氨基酸残基的突变、缺失或添加来产生，从 而产生典型的共有糖基化位点。
[0092]在具体的实施方案中，本发明涉及含有人类(或哺乳动物）IL_7多肽的IL-7多肽， 该多肽含有一个或几个从 Lys28Asn-Ile30Ser-Ile30Thr-Ile30Asn-Ser32Thr-Leu35Ser-Leu35Thr-Glu38Ser-Glu38Thr-Phe39Ser-Phe39Thr-Phe42Ser-Phe42Thr-Glu52Ser-Glu52Thr-Val82Asn-Glu84Thr-Glu84Ser-Lys97Asn-Arg99Thr-Arg99Ser-Alal02Asn-Leul04Thr-Leul04Ser-Leul04Asn-Glul06Thr-Glul06Ser-Leul28Ser-Leul28Thr-Ilel45Asn-Metl47Thr-Metl47Ser-Metl47Asn-Thrl49Ser (或从其它哺乳动物 IL-7 多肽中 对应的位置)中选择的氨基酸修饰。
[0093]本发明的(人类)IL_7多肽的具体例子包括在下面的表1中公开的氨基酸修饰：
[0094] 表 1
[0095]
[0096]
[0097] 上面的氨基酸修饰产生N-糖基化位点而基本上不改变IL-7的结合亲和性，从而产 生了本发明的改进的IL-7多肽。
[0098] 术语"基本上不改变结合亲和性"是指结合亲和性没有被改变，或者可能被减小， 但不影响由与受体相互作用而产生的体内效应。当在体外定量时，结合亲和性可以被减少 小于50%、优选小于40%、优选小于30%、优选小于20%、优选小于5%。
[0099] 上面的修饰也可以被组合以在本发明的IL-7多肽中产生几个其它的糖基化位点。 在这一方面，本发明涉及了具有通过添加了至少1个到4个其它的(N-连接)糖基化位点而修 饰的(人类或哺乳动物）白介素 -7的一级序列的任何生物活性的IL-7多肽。本发明的另一个 优选实施方案是含有包含了一个或两个其它的(N-连接的）糖基化位点的白介素-7的一级 序列的生物活性IL-7多肽。
[0100] 本发明的最优选的IL-7多肽是生物活性的，即它们能够与白介素-7受体结合，在 特定的生物分析中显示出体外活性，和/或在体内具有增加的平均存留时间(MRT)。在剂量/ 反应生物分析研究中进行了未糖基化的标准品与超糖基化的IL-7的活性的比较，其中ED50 值对应的剂量等于最大活性的一半。超糖基化通常在生物分析中导致减小的活性，但没有 转变成体内活性的减小。在目前状态下，扩展的动力学分布情况事实上将提高体内活性。 [0101]尽管ED50不反映 IL-7的体内活性，它允许在具有同样的糖基化水平的不同样品之 间进行比较。在这种框架下，未糖基化的标准品的典型的ED50值范围在0.5到2. Ong IL-7/ ml之间，而超糖基化的ED50的值范围在1.5到3.5ng超糖基化IL-7/ml之间。
[0102]本发明的超糖基化IL-7多肽显示出改进的稳定性、体内延长的半衰期和在哺乳动 物宿主中延长的平均存留时间。术语"改进的稳定性"、"延长的半衰期和平均存留时间"应 该被理解为是与未糖基化的形式相比较。优选情况下，半衰期的增加至少是大约3倍，优选 至少大约5到20倍。平均存留时间(MRT)是指在第一次用药之后每个IL-7分子在病人血液中 存留时间的平均值。优选情况下，与未糖基化的形式的MRT相比，MRT的增加至少为大约2倍， 或优选至少大约4到10倍。
[0103] 例如，超糖基化的形式的血浆半衰期被显示为在30到40小时的范围内，而未糖基 化形式的血浆半衰期通常为5到8小时(两种形式在相同的条件下被给药，即在一次皮下注 射中同时给药）。
[0104] 平均存留时间(MRT)是大约40小时，而未糖基化的形式是大约10小时。
[0105]应该理解，本发明也涵盖了本发明的IL-7多肽的任何独特片段，即任何含有上面 公开的氨基酸修饰的片段，或任何含有上面公开的人工产生的糖基化位点的片段。这样的 片段典型地含有至少5个氨基酸残基，典型地至少8、9、10、11、12或15个残基，并可以含有多 达20、30、40、50或更多的连续的氨基酸残基。这样的片段可以用作拮抗物或免疫原，以产生 特异性抗体。
[0106] 此外，尽管上面的氨基酸位置是参照人类IL-7多肽序列给出的，应该理解本发明 也涵盖了具有通过在哺乳动物序列中基于对人类序列的序列比对进行同源突变而修饰的 哺乳动物IL-7的一级序列的IL-7多肽。
[0107] 本发明的优选实施方案涉及新的生物活性IL-7多肽，其中含有从包含下列修饰的 组中选择的一个或几个氨基酸修饰：
[0108] Phe39Ser-Phe39Thr-Phe42Ser-Phe42Thr-Leul04Asn-Glul06Thr-Glul06Ser-Leul28Ser-Leul28Thr-Metl47Asn及其组合，或其独特的片段。
[0109] 本发明的最优选的修饰的IL-7多肽被公开在下面的表2中：
[0110] 表2
[0111]
[0112]本发明的另一个具体的目标是含有上面公开的一级氨基酸序列的超糖基化的IL-7多肽。
[0113]寡糖单位
[0114] 在本发明的超糖基化的IL-7多肽中结合到特定的糖基化位点上的寡糖单位的结 构和数量可以是变化的。它们可以是例如N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳 糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸和/或唾液酸。
[0115] 更优选情况下，超糖基化的IL-7多肽含有(或富集了）从下面选择的N-连接的和/ 或〇-连接的糖链：
[0116] a)哺乳动物类型的糖链，优选为CH0细胞表达的类型；
[0117] b)含有复杂的N-糖链(例如三天线(triantenary)或二天线(biantenary)结构）的 糖链，更优选含有高含量的甘露糖和乙酰葡糖胺分子和高含量的末端唾液酸残基；
[0118] c)含有0-糖链，没有但优选具有末端唾液酸残基的糖链；
[0119] d)被α2，6-唾液酸转移酶或α2，3-唾液酸转移酶唾液酸化的糖链;和/或
[0120] e)显示出3到30个之间的唾液酸基-Ν-乙酰半乳糖胺的唾液酸化的糖链，优选为7 到23个。
[0121] 特别优选的糖链含有三天线或二天线结构，具有部分或完全的末端唾液酸化。另 一个优选的糖链含有三天线结构和三或双唾液酸化，和/或具有双唾液酸化的二天线结构。 这样的糖的例子被公开在表4中，包括基序#2420、2623、2785和3092。
[0122] 根据另一个具体的实施方案，本发明的超糖基化的白介素-7多肽具有低于6.5的 平均等电点和超过27kDa，在28KDa和65KDa之间（7N+10糖基化的理论值）的平均表观分子 量，优选在28KDa和35KDa之间（正如3N+10糖基化所显示的那样），这是通过凝胶电泳测定的 (通过Western印迹印证），所述分子量通过质谱分析检测为25kDa。
[0123] 在具体的实施方案中，本发明的超糖基化的IL-7多肽由哺乳动物糖基化突变体生 产，该突变体稳定地表达α2，6-唾液酸转移酶，并存在CMP-Neu5Ac水解酶活性缺陷，优选为 CH0糖基化突变体。这样的糖基化典型包括N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳 糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸和/或唾液酸。
[0124] 在另一个实施方案中，超糖基化的IL-7多肽通过重组技术在人类宿主细胞中产 生，该宿主细胞可以从人类基质或上皮细胞系、HEK-293(人类胚胎肾）、HER(人类胚胎视网 膜）、HEK(人类表皮角质细胞）、人类胸腺或人类皮质上皮细胞系、人类骨髓或人类骨髓基质 细胞株中选择。
[0125] 本发明的最优选的超糖基化白介素-7多肽显示出下列特点：
[0126] a)它们在重组生产细胞株中具有改进的分泌分布情况和生产率;和/或
[0127] b)它们每个IL-7多肽含有高度的唾液酸残基，导致降低了等电点值并改进了平均 存留时间；和/或
[0128] c)它们被保护免于分子间聚集;和/或
[0129] d)它们对蛋白水解作用具有减少的易感性;和/或
[0130] e)它们含有被掩盖的抗原位点，反映出减小的免疫原性倾向，减小的对APC(抗原 呈递细胞)捕获、被MHCII分子加工和呈递的易损性(vulnerability);和/或
[0131] f)它们具有增加的化学稳定性;和/或
[0132] g)它们与未糖基化的父本肽相比具有延长的体内生物学半衰期（IL-7的长作用同 工型）