；和/或
[0133] h)与未糖基化的父本蛋白相比，它们具有增加的体内药物活性，这主要是由于较 好的平均存留时间(MRT);和/或
[0134] i)它们允许较低频率的给药方案，从每星期3/4次降低到每星期两次或一次，或对 更长效产品来说每两星期一次;和/或
[0135] j)它们显示出改进的药物动力学情况(减少的峰浓度和改进的平均存留时间）， 和/或
[0136] k)它们显示出通过质谱分析确定的平均分子量大于25KDa，或通过SDS-PAGE确定 的平均分子量大于27KDa，平均等电点低于6.5。
[0137] 本发明的多肽可以是单体的形式，或者与选定的特定化合物结合或复合。在这一 方面，在特定的实施方案中，IL-7构象异构体与肝细胞生长因子（"HGF"）结合形成异源二聚 体。异源二聚体可以通过络合作用化学获得，或通过重组技术(即通过遗传融合)获得。
[0138] 在另一个特定实施方案中，IL-7多肽与IgG重链的Fc部分在功能上相连，典型是通 过肽铰链区。这样的融合分子潜在地增加了体内稳定性和半衰期。最优选的IgG基团是人类 IgGl或IgG4。
[0139] 在另一个特定的实施方案中，IL-7多肽与人类血清白蛋白（"HSA"）或HSA的一部分 在功能上相连成为融合蛋白。这样的融合分子潜在地增加了体内稳定性并延长了半衰期。
[0140] 本发明的另一个目标是超糖基化的IL-7组合物。这样的组合物优选含有至少 80%、优选在80%到95%之间的的IL-7多肽，所述多肽在至少三个不同的氨基酸残基上被 糖基化，糖基化位点可以是天然存在于IL-7多肽序列中（例如共有的N-连接和0-连接糖位 点），也可以/或是人工产生的糖基化位点，正如前面讨论的那样。
[0141] 按照具体的特定实施方案，本发明涉及的超糖基化的IL-7组合物包含：
[0142] a)大部分(>80%，优选大于90%，最优选大于大约95% )为白介素-7，它们在3个共 有的N-连接糖位点(Asn 70/91 /116)上被糖基化，在1个0-连接糖位点（Thr 110)上被糖基 化或未糖基化;优选情况下，组合物含有少量(〈20%，优选少于大约10%)只在（与或不与1 个〇-连接糖位点相连的）2个共有的N-连接糖位点上被糖基化的白介素-7,和/或组合物基 本上不含有单糖基化或未糖基化的蛋白；或
[0143] b)大部分(>80%，优选大于90%，最优选大于大约95%)为生物活性白介素-7类似 物，具有修饰的IL-7-级氨基酸序列，引入了另一个糖基化位点，总共在4个N-连接的糖位 点上以及另外在或不在1个〇-连接糖位点上(Thr 110)被糖基化;优选情况下，组合物含有 少量(〈20%，优选少于大约10%)同样的类似物，所述类似物只在(与或不与1个0-连接糖位 点相连的）3或2个N-连接糖位点上被糖基化，和/或组合物基本上不含有单或未糖基化的蛋 白；或
[0144] c)大部分(>80%，优选大于90%，最优选大于大约95%)为白介素-7生物活性类似 物，具有修饰的IL-7-级氨基酸序列，引入了另两个糖基化位点，总共在5个N-连接的糖位 点上以及另外在或不在1个〇-连接糖位点上(Thr 110)被糖基化;优选情况下，组合物含有 少量(〈20%，优选少于大约10%)同样的类似物，所述类似物只在与或不与1个0-连接糖位 点相连的4、3或2个N-连接糖位点上被糖基化，和/或组合物基本上不含有单糖基化或未糖 基化的蛋白；或
[0145] d)大部分(>80%，优选大于90%，最优选大于大约95%)为白介素-7生物活性类似 物，具有修饰的IL-7-级氨基酸序列，引入了另三个糖基化位点，总共在6个N-连接的糖位 点上以及另外在或不在1个〇-连接糖位点上(Thr 110)被糖基化;优选情况下，组合物含有 少量(〈20%，优选少于大约10%)同样的类似物，所述类似物只在与或不与1个0-连接糖位 点相关的5、4、3或2个N-连接糖位点上被糖基化，和/或组合物基本上不含有单糖基化或未 糖基化的蛋白；或
[0146] e)大部分(>80%，优选大于90%，最优选大于大约95%)为白介素-7生物活性类似 物，具有修饰的IL-7-级氨基酸序列，引入了另四个糖基化位点，总共在7个N-连接的糖位 点上以及另外在或不在1个ο-连接糖位点上(Thr 110)被糖基化;优选情况下，组合物含有 少量(〈20%，优选少于大约10%)同样的类似物，所述类似物只在与或不与1个0-连接糖位 点相关的6、5、4、3或2个N-连接糖位点上被糖基化，和/或组合物基本上不含有单糖基化或 未糖基化的蛋白。
[0147] 本发明还涉及了含有上述的作为活性物质的组合物的药物组合物。
[0148] 核酸
[0149] 本发明的另一个目标在于编码上面讨论的IL-7多肽的核酸分子。核酸分子可以是 任何DNA或RNA分子，典型为cDNA分子。
[0150]本发明的具体的目标是含有SEQ ID NO:2从79位到结束的核苷酸残基的核酸，及 其独特的片段和互补链。
[0151]本发明的另一个目标是含有SEQ ID NO:4的核酸，及其任何独特的片段、其变异体 (与SEQ ID N0:4具有至少90%的一致性）、及其互补链。
[0152]本发明的另一个目标是含有SEQ ID N0:6的核酸，及其任何独特的片段、其变异体 (与SEQ ID N0:6具有至少90%的一致性）、及其互补链。本发明的具体的目标是含有SEQ ID N0:6从79位到结束的核苷酸残基的核酸，及其变异体(与SEQ ID N0:6具有至少90%的一致 性）、及其互补链。本发明也涵盖了由这样的序列（例如SEQ ID N0:7)所编码的多肽。
[0153] 上面使用的术语"变异体"对于核酸来说，更具体是指能够在严紧条件下与参比序 列杂交的核苷酸序列，和/或编码与参比序列编码的多肽具有同样类型的活性的多肽的核 苷酸序列。最优选情况下，变异体与参比序列相比表现出至少在92%和99%之间（例如 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 的一致性。
[0154] 本发明的另一个具体的目标是含有下列序列的核酸：
[0155] CTG AAT AAC GAA ACT AAC SEQ ID NO: 8 AAC TTC ACT A AG SEQ 丨 D NO: 9 GCC AAC GGT ACC SEQ ID NO: 10
[0156] CTG AAC GAC AGC TGT SEQ ID NO: 1 1，成 ATC TTG AAC GGG S:EQ ID HO: 12，' 或它们的组合
[0157] 本发明的核酸的具体例子含有在SEQ ID N0s:8到12任何一个中显示的核苷酸序 列。
[0158] 本发明的另一个目的在于含有上面定义的核酸分子的克隆和/或表达载体。载体 可以是任何原核或真核载体，典型为真核载体，可以从质粒、粘粒、病毒载体、人工染色体等 中选择。载体可以含有任何允许编码核酸在选定的宿主细胞中适当表达的调控序列，例如 启动子、终止子、polyA、复制原点、整合区域(例如同源区域）、内含子、UTR序列、标记物基因 等。
[0159] 本发明的一个具体的目标是含有上面定义的核酸分子的表达载体，包括信号肽， 可操作地连接到调控元件以允许该核酸在哺乳动物宿主或宿主细胞中表达。
[0160] 优选的调控元件包括启动子，它可以从病毒、细胞和合成启动子中选择，但不限于 此，包括组成型的、组织特异性的或受调节的启动子，特别是选自CMV启动子、E1F启动子和 金属硫蛋白启动子的启动子。其它可以被包含在本发明的载体中的调控元件包括但不限于 Be 1-2基因、UTR序列和MAR序列。
[0161] 在优选实施方案中，载体是游离的表达载体。
[0162] 上述的核酸和载体可以用于例如在各种感受态宿主或宿主细胞中生产重组哺乳 动物IL-7多肽，以及用于基因治疗目的。
[0163] 本发明的另一个目标在于含有上面公开的核酸或载体的重组宿主细胞。这样的重 组细胞可以是原核的，或更有选是真核的，例如酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
[0164] 在优选实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，优选从PERC6、NS0细胞和BHK细胞 中选择，优选为CH0细胞，或人类细胞系。载体、构建物和重组细胞将在本申请的后面部分中 更详细地公开，但不限于此。
[0165] 药物物质和药物组合物
[0166] 本发明的另一个目标在于含有所需产物，即上面描述的IL-7多肽、典型为超糖基 化的IL-7多肽的药物物质。更优选情况下，药物物质含有少于大约10%的未糖基化或单糖 基化的IL-7多肽，并且/或基本上不含与产物有关的杂质。
[0167] 本发明还涉及使用上述的药物物质生产药物（"药物产品"）或药物组合物。
[0168] 优选的药物物质还基本上不含与处理相关的杂质。
[0169] 在本发明中，术语"药物物质"是指适合用作药物的活性要素的产品。本发明的"药 物物质"在本质上是复合产品，即作为其生产方法(例如重组DNA技术)的结果。
[0170] 本发明现在揭示，为了产生有效的治疗和疫苗增强效应，IL-7药物物质或药物组 合物应该含有超糖基化的IL-7多肽组合物作为主要的分子种类。
[0171] 本文中使用的术语"基本上不含"是指药物物质不含显著量或有害量的与产品相 关的杂质和与处理方法相关的杂质。更具体来说，药物物质将含有少于5%、更优选少于、更 优选少于2%的与产品相关的杂质和与处理方法相关的杂质。最优选的药物物质含有少于 大约1 %的与产品相关的杂质和仅仅痕量的与处理方法相关的杂质。
[0172]与IL-7产品相关的物质是指IL-7分子变异体，包括例如有活性或无活性的IL-7肽 或多肽片段。
[0173] 与IL-7相关的杂质包括例如含有单或双二硫桥的人类IL-7多肽、截短的IL-7、脱 酰胺的重组IL-7、含有IL-7的二聚体或多聚体蛋白、氧化型甲硫氨酸形式或其组合。
[0174] 无论其生物活性如何，这些IL-7分子变异体和IL-7相关的杂质应该严格地最小化 或从药物物质中丢弃。
[0175] 与处理方法相关的杂质包括DNA、内毒素、细胞碎片、病毒等。
[0176] 因此，优选的药物物质是其中超糖基化IL-7组合物的总重量中含有重量百分比至 少为95%、优选至少98%、更优选至少99.5%的本发明的超糖基化IL-7组合物的药物物质。
[0177] 本发明还涉及了药物组合物，其含有有效量的上面描述的药物物质或超糖基化的 IL-7组合物以及一种或多种药物相容或可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0178] 本发明显示，含有上述超糖基化的IL-7组合物的药物组合物明显地增加了IL-7的 疫苗性质和它刺激抗原特异性免疫反应的能力。
[0179] 药物相容的或生理可接受的载体、赋形剂或稀释剂可以从中性到微酸性、等渗的、 缓冲盐溶液或悬浮液中选择，更优选从蔗糖、海藻糖和氨基酸中选择。药物相容的载体优选 被包含在适当的缓冲液中以形成等渗溶液。适合的缓冲液优选具有的pH范围包括在4.5到 7.5之间，优选5.0到7.0，更有选大约5.5，优选为从柠檬酸钠缓冲液或乙酸铵缓冲液中选择 的有机酸盐。药物组合物可以采取悬浮液、溶液、凝胶、粉末、固体等形式。组合物优选为液 体形式。
[0180]组合物可以含有稳定剂，例如糖、氨基酸、蛋白、表面活性剂等。组合物可以含有任 何盐溶液，包括磷酸盐、氯化物等。
[0181 ]本发明的特定的药物组合物，除了活性药物物质之外，还包含蛋白和/或表面活性 剂。蛋白或任何其它高分子量的天然来源的分子的存在，减少了 IL-7在宿主免疫系统中的 暴露，从而避免了次级效应。更优选情况下，蛋白在受试者中是无免疫原性的，例如任何人 类来源的蛋白。蛋白的最优选的例子是人类血清白蛋白。表面活性剂可以从已知的表面活 性剂中选择，例如聚山梨酸酯产物，优选为Tw een20?或TweenSO?。本发明的具体的组合物 含有人类血清白蛋白（优选2到5mg/ml)或聚山梨酸酯(Tween 20或80(典型为0.005%))或 任何其它物质例如表面活性物质或氨基酸(例如精氨酸、谷氨酸、或精氨酸和谷氨酸的混合 物)或糖(例如蔗糖、海藻糖、山梨醇），能够防止由于蛋白聚集和/或给药组合物后药物产品 在注射位点处的局部持久存在而引起的IL-7的免疫原性。
[0182] 在这一方面，本发明的具体目标在于含有浓度为大约lmg/ml到50mg/ml、优选为大 约3mg/ml到20mg/ml的超糖基化的白介素-7组合物的药物组合物。优选情况下，例如在治疗 或预防传染病的情况下，被给药的糖基化的白介素-7的有效量在大约10到200yg/kg/星期 之间，优选在大约10到eOyg/kg/星期之间。
[0183] 鉴于本发明的多肽和组合物的改进的性质，在使用等价剂量以获得可比较的治疗 效果的情况下，药物组合物需要使用的频率低于现有技术的组合物或产品的使用频率。更 具体来说，在典型的实施方案中，组合物的使用每星期3次、每星期2次、每星期1次、每两星 期1次、每月1次、疫苗接种前或疫苗接种之前和之后1次或2次。优选的剂量方案包括每7、10 或14天给药1次药物组合物。
[0184] 优选的给药途径是肠胃外途径。肠胃外途径优选为肿瘤内给药、更有选为静脉内 或皮下给药。此外也包括动脉内、腹膜内或肌肉内注射。但是，应该理解，依赖于病人的健康 状态和反应性，任何其它适合的给药途径也可以被考虑。
[0185] 在具体的实施方案中，给药途径是口服途径。与其它多肽激素相比，由于超糖基化 的IL-7的异常的稳定性，口服途径对于该蛋白来说事实上是可以接受的。本发明的组合物 优选为固体形式，例如片剂或粉末或胶囊，也可以是液体形式，例如在适合的可药用的载体 中制备的糖浆或乳浊液。优选载体本身在胃肠道和循环系统中是稳定的，并表现出可接受 的血衆半衰期。
[0186] 抗胃酸胶囊、例如含有超糖基化的IL-7多肽的微乳浊液或脂质体配方的抗胃酸胶 囊，是有优势的。
[0187] 药物组合物可以含有其它的活性成分，例如免疫刺激剂，优选从造血细胞生长因 子、细胞因子、抗原性分子(或抗原)和可以组合、分别或顺序使用的佐剂中选择。
[0188] 这种另外的活性成分可以与IL-7-起配制，也可以分别配制，用于组合、分别或顺 续使用。在第一种情况下，活性成分被一起配制在同样的容器中。在另一种优选的情况下， 它们被分别调制，即在不同的容器中。按照本实施方案，成分可以分开使用，例如同时或顺 续使用（例如在不同的注射位点或不同的时间点），以产生最有效的生物效应。正如上面提 到的那样，可以重复给药1次或2次活性成分。
[0189] 在这种情况下，本发明涉及药物组合物，其含有上述的超糖基化的IL-7组合物和 选自免疫刺激剂和抗原性分子的活性成分，以组合、分别或顺序使用。佐剂优选分开配制。
[0190] 造血细胞生长因子优选从干细胞因子（SCF)、特别是可溶形式的SCF、G-CSF、GM-CSF、Flt-3配体、IL-15和IL-2中选择。用于疫苗增强的细胞因子或趋化因子的典型例子包 括诱导和/或刺激Thl-类型的免疫反应的细胞因子。细胞因子优选从α或V-干扰素、IL-2、 11^-12、1^1^^3、87-1、11?-2和11?-1€[中选择。应该理解，其它的因子例如疆细胞活化剂和/ 或ΝΚΤ细胞活化剂、FGF7或FGF10、白介素和/或激素可以与IL-7结合使用，以提供其它的治 疗益处。
[0191] 本发明的特定组合物含有上述的超糖基化的IL-7组合物和干细胞因子、特别是其 可溶形式、IL-15和/或Flt-3配体和/或FGF10。
[0192] 本发明的另一种特定组合物含有上述的超糖基化的IL-7组合物和从α或γ -干扰 素、几-2、11^-12、1^1^^3和]\0?-1€[中选择的细胞因子。
[0193] 本发明的另一种特定组合物含有上述的超糖基化的IL-7组合物、干细胞因子和细 胞因子。
[0194] 正如上面指出的那样，药物组合物还可以含有一种或几种抗原（或抗原性分子）， 以组合、分别或顺续使用。抗原可以是任何合成的或天然的肽、重组蛋白、杀死的、失活的或 减毒的病原产物、微生物、寄生物、脂类等，及其部分和其组合。抗原可以是完整的蛋白、或 其任何含有表位的片段或部分、特别是通过I类和II类MHC分子呈递到免疫系统中的肽。抗 原可以是任何病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤抗原等。抗原的具体例子包括从HIV、 水痘带状疱疹病毒、流感病毒、Epstein Barr病毒、I型或II型单纯性疱疹病毒、人类巨细胞 病毒、登革热病毒、甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人类乳头状瘤病毒、结 核分枝杆菌、弓形虫和衣原体衍生的抗原。
[0195] 本发明的一个具体的目标涉及含有上述的超糖基化IL-7组合物和抗原性分子的 组合物，以组合、分别或顺序使用。组合物还可以包含一种或几种上面公开的免疫刺激剂， 以组合、分别或连续使用。
[0196] 本发明的另一个具体的目标涉及含有上述的超糖基化IL-7组合物的药物组合物， 其中该药物组合物与一种或几种抗原性分子同时、提前几天或连续使用，以在受试者中获 得和/或刺激抗原特异性的免疫反应。
[0197] 本发明的另一个具体目的涉及在受试者中引起或增强抗原特异性免疫反应的方 法，包括给受试者给药该抗原（或其含有表位的片段)和上面描述的超糖基化的IL-7组合 物。组合物可以与该抗原同时、提前几天或顺序给药，更优选在给药该抗原之前使用，以在 受试者中获得和/或刺激抗原特异性的免疫反应。
[0198] 在另一个优选实施方案中，本发明的组合物还含有佐剂。佐剂可以从任何促进或 增加抗原的免疫原性并能够诱导Thl类型的免疫反应的物质、混合物、溶质或组合物中选 择，例如CpG、QS21、ISC0M和单磷酰脂A。这样的佐剂特别适合于在哺乳动物受试者、特别是 人类中产生和/或放大针对抗原的特异性免疫反应。佐剂优选与含有IL-7的组合物分开调 制和使用，和/或在不同的位点注射，优选与所需的抗原一起。
[0199] 本发明还涉及含有有效量的本发明的人类超糖基化IL-7组合物，与适合的稀释 剂、赋形剂或载体混合的药物组合物，通过肠胃外给人类病人使用，以预防性或治疗性刺激 B或T淋巴细胞的发育和增殖，或用于增强免疫反应。本发明的药物组合物诱导了延长的淋 巴细胞生成刺激和/或放大的免疫反应。
[0200]本发明的药物组合物也可以用于人类病人以预防性或治疗性刺激B或T淋巴细胞 的发育和增殖，用于增强全面的和/或特异性免疫重建，或用于增强体液和/或细胞免疫反 应。
[0201 ]本发明的具体的药物组合物被用于在免疫缺陷病人中阻止或减少机会性感染。
[0202] 本发明的另一个具体的药物组合物被用于延长淋巴细胞生成刺激，和/或产生不 仅针对主要表位、而且针对次主要或较少免疫原性的表位、对T细胞受体具有较低的亲和性 的表位的特异性免疫反应，这将允许在人类病人中扩展特异性免疫反应的总组成成分。
[0203] 本发明特别适合于在受试者中产生保护性或治愈性免疫反应，这些受试者例如免 疫缺陷病人、癌症病人、经历移植的病人、病毒或寄生虫感染的病人、老年病人或任何具有 低的CD4计数的病人等。
[0204] 本发明的IL-7多肽和组合物的具体和优选的应用包括下列应用：
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