05] -以能够有效诱导针对恶性细胞或感染因子的特异性免疫反应增强的量作为疫苗 增强剂(该组合物的给药在抗原给药之前、之中或基本上同时使用）；以及
[0206] -诱导无论何种来源的病人的免疫重建:传染、辐射、移植(BMT、SCT)或药物；
[0207] 本发明的IL-7多肽和组合物可以单独使用，也可以与其它活性成分组合使用，例 如淋巴细胞生成因子，包括但不限于SCF、Flt3-L、a-IFN、y-IFN、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、 IL-15、IL-18和/或IL-21。在使用组合疗法时，各种成分可以同时、分别或顺序使用，可以一 起或分开调制。
[0208] 本发明的IL-7多肽和组合物可以用于各种领域，包括在动物健康领域增强疫苗的 接种，以及最小化活性物质给药的次数。
[0209] 本发明还提供了治疗病毒感染、例如HI V感染、病毒性肝炎、西尼罗河热、登革热感 染的方法，该方法包括给感染的病人使用超糖基化的IL-7多肽组合物。
[0210] 在具体的实施方案中，超糖基化的IL-7组合物将与干扰素分子结合使用。干扰素 分子可以是例如a_IFN(白细胞IFN) 4-IFN(成纤维细胞IFN)、γ -IFN(免疫IFN)、ω -IFN或 τ-IFN(滋养母细胞因子）。
[0211] 本发明还提供了用于在免疫减弱的受试者中改善胸腺生成恢复的方法，该方法包 括给免疫减弱的受试者使用超糖基化的IL-7多肽组合物。
[0212]优选情况下，超糖基化的IL-7多肽与角质细胞生长因子、干细胞因子、 gonadostimulin诘抗剂或生长激素结合使用。
[0213] 超糖基化的IL-7多肽也可以用在提供针对恶性细胞、病毒或细菌的治疗性免疫的 方法中，其中超糖基化的IL-7多肽将与抗原或抗原混合物、例如上面描述的那些结合使用。 在这种情况下，超糖基化的IL-7多肽还可以与GM-CSF结合使用。
[0214] 本发明的另一个目标是离体增强T细胞的扩增的方法，该方法包括将T细胞与超糖 基化的IL-7多肽或组合物相接触，从而增强T细胞的增殖。该方法对于制备适合于通过过继 性免疫疗法治疗患有癌症或病毒感染的病人的T细胞来说是特别有用的。过继性免疫疗法 是离体方法，用于选择性扩增靶向特定抗原(恶性肿瘤或病毒)的特定T细胞。该免疫治疗技 术通常包括从病人的全血中分离抗原特异性T淋巴细胞，使用IL-7多肽离体扩增这些T细 胞，也可以选择通过其它细胞因子离体活化这些Τ细胞，并给病人使用。其它的技术也是可 能的。IL-7多肽改进了这些Τ细胞种群的存活，这进一步显示了增强的细胞毒性活性。
[0215] 生产方法和工具
[0216] 本发明的另一方面是提供适合的构建物和方法，以足够用于药物应用的数量和质 量生产上述的组合物、特别是上面的超糖基化的IL-7多肽、组合物和药物物质。
[0217] 具体来说，正如上面讨论的那样，本发明提供了可以在各种感受态宿主细胞中生 产本发明的重组人类IL-7多肽、并用于基因治疗目的的载体和重组宿主细胞。
[0218] 载体可以是质粒、病毒、噬菌体、粘粒、游离体等。优选的载体是病毒载体(例如重 组腺病毒)和质粒，它们可以基于可商业获得的骨架生产，例如pBR、pcDNA、pUC、pET、pVITRO 等。载体典型地含有控制或介导IL-7多肽的表达的调控元件或序列。调控序列可以从启动 子、增强子、沉默子、组织特异性信号、肽信号、内含子、终止子、polyA序列、GC区域，或其组 合等中选择。这样的调控元件或序列可以从哺乳动物、真菌、植物、细菌、酵母、噬菌体或病 毒基因衍生，也可以从人工来源衍生。用于原核细胞表达(例如大肠杆菌）的有用的启动子 包括例如T7RNA聚合酶启动子(pT7)、TAC启动子(pTAC)、Trp启动子、Lac启动子、Tre启动子、 PhoA启动子。适合用于在哺乳动物细胞中表达的启动子包括病毒启动子（例如CMV、LTR、 1^￥、3￥40、11(、？046等）、看家基因启动子^技阳1匕鸡&1(^116、泛素、1吧11等）、杂交启动子 (例如actine/珠蛋白等)等。载体可以含有一个以上的启动子。启动子可以是可诱导的或被 调控的。例如，使用可诱导的或被调控的启动子允许通过使培养物与生产阶段分离对生产 进行较好的控制。可诱导的或被调控的启动子可以在文献中发现，例如四环素系统、 Geneswitch系统、Ecdysone系统、Oestradiol系统、RU486系统、Cumate系统、金属硫蛋白启 动子等。其它的系统基于电流或微波，例如聚焦超声系统、AIR诱导的表达系统等。这些系统 可以用于控制本发明的IL-7多肽的表达。
[0219] IL-7可以与抗凋亡因子(例如iex、BC12、BClXL等)或周期蛋白（例如p21、p27等)共 表达。为该IL-7和该抗凋亡因子编码的cDNAs可以都位于同样的启动子下游，但是被IRES序 列分开，它们各自也可以位于其自身的启动子的下游。
[0220] 载体还可以含有复制原点和/或标记物基因，它们可以从常规的序列中选择。扩增 选择性标记物例如DHFR基因可以被插入到载体的骨架中。
[0221] 载体还可以含有这些不同元件的各种组合，它们可以以不同的方式组织。
[0222] 本发明还提供了含有上面描述的核酸或载体的重组宿主细胞。宿主细胞可以从任 何真核和原核细胞中选择，典型地从哺乳动物细胞(特别是人类、啮齿类、犬类）、细菌细胞 (特别是大肠杆菌E.coli、短芽胞杆菌Bacillus brevis、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)、酵母细胞、植物细胞和昆虫细胞中选择。这些宿主细胞可以适应于无血清培养 基。生产也可以在转基因动物或植物中完成。
[0223] 优选的重组宿主细胞从哺乳动物细胞中选择，特别是人类细胞及其衍生物或突变 株。
[0224] 适合的宿主细胞的具体例子包括中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、幼仓鼠肾脏(BHK)细 胞、人类胚胎肾脏(HEK-293)细胞、人类表皮角质细胞(HEK)、人类基质或表皮细胞、PERC6 等。在这些哺乳动物细胞中，IL-7可以使用功能性信号肽序列生产为分泌蛋白。
[0225] 本发明的一个具体目标是包含含有SEQ ID N0:2、4或6的核酸分子的真核宿主细 胞。
[0226] 本发明的另一个目标涉及与上面描述的IL-7组合物或多肽具有免疫反应性的抗 体。这样的抗体可以按照常规的方法生产，包括免疫动物和收集血清（多克隆）或从脾脏细 胞制备杂交瘤(单克隆）。可以通过已知的生物学和化学方法生产抗体的片段(例如Fab'）或 工程化衍生物（例如ScFv或双功能抗体或微型抗体）。优选的抗体与上面描述的超糖基化 IL-7多肽具有特异的免疫反应性，即可以结合超糖基化的IL-7多肽，而基本上不结合未糖 基化或单糖基化的多肽。尽管也可以观察到与这些其它抗原的非特异性或低效率的结合， 这样的非特异性结合可以同与本发明的特定超糖基化的IL-7多肽的特异性结合区分开来。
[0227] 抗体优选为猿、鼠或人类来源的，或已经被人源化。
[0228] 本发明还涉及了产生上面描述的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0229] 这样的抗体可用于检测超糖基化的IL-7多肽，或在包含多个淋巴细胞因子的分析 或实验中中和IL-7的生物活性。含有这样的单克隆抗体，适合用于诊断、测试或治疗的组合 物也是本发明的一个目标。
[0230] 本发明的另一个目标涉及可以在工业规模上用于生产药物级的、基本上纯的上述 超糖基化IL-7多肽的方法。该方法产生高收率的适用于治疗应用的的重组IL-7构像异构 体。本发明还提供了新的控制含有IL-7组合物的方法，以确定上述的超糖基化IL-7多肽存 在的量。
[0231] 在特定情况下，上面定义的生产超糖基化IL-7多肽或组合物的方法包括：
[0232] a)培养上述的重组宿主细胞，以及
[0233] b)收集从该细胞产生的IL-7多肽。
[0234] 样品可以被用于进行各种处理或调制，以增加 IL-7的纯度、移除细胞碎片或病毒 颗粒等。这样的处理的典型的例子包括离心、澄清和/或透析、超滤、纳滤。从而可以使样品 富集IL-7多肽。
[0235] 为了增加方法的收率或效率，非常希望生产含有或富集了正确折叠和糖基化的 IL-7多肽的样品。
[0236] 超糖基化的IL-7多肽可以通过目前已知的、但尚未被用于组合生产超糖基化IL-7 多肽的不同技术来进行纯化。这些技术更优选从疏水相互作用层析、离子交换层析、亲和层 析和凝胶过滤层析中选择，可以单独使用，也可以以不同的方式组合使用。这些方法允许除 去宿主细胞DNA和其它会降低回收率的杂质。在优选实施方案中，步骤ii)包含疏水相互作 用层析步骤。这样的层析可以使用不同的支持物和形式进行，优选使用HIC 丁基。步骤ii)可 以在任何支持物上进行，优选使用适合的凝胶分批或在柱中进行。
[0237] 在优选实施方案中，纯化步骤包括将样品上样于填充有特定凝胶(例如Sephadex) 的柱子中。
[0238] 在另一个优选实施方案中，纯化步骤包含精制步骤，包括将样品上样于填充有特 定凝胶(Sour ce 15S)的柱子以浓缩回收的所需蛋白并除去可能的残余蛋白污染物。
[0239] 在另一个特定实施方案中，纯化步骤包括将样品上样于填充有特定凝胶的柱子， 该凝胶含有固定在树脂(例如硫酸葡聚糖或肝素)上的单克隆抗IL-7抗体。
[0240] 这些方法允许可重复地和有效地生产上面描述的基本上纯的超糖基化IL-7多肽。 这些方法是特别有利的，因为可以获得的重组IL-7相对于IL-7总量来说具有至少95%重量 比、优选至少98 %重量比、更优选至少99 %、甚至99.5 %重量比的纯度。
[0241] 上面描述的方法中的每一步都可以通过分析方法、包括SDS-PAGE分析来控制。最 适化的IL-7的一级结构可以通过确定基因和/或氨基酸序列、通过胰蛋白酶消化后进行肽 作图分析、通过用SDS-PAGE、孔径排阻HPLC、质谱分析例如MALDI T0F或电喷射质谱等测定 分子量、通过例如反向HPLC测定疏水性、和/或通过例如阳离子交换层析HPLC或等电聚焦分 析测定电荷来进行控制和定性。
[0242] 本发明的另一个实施方案涉及上述的IL-7生产方法，其中IL-7被重组宿主细胞的 表达是可诱导的、被调控的或短暂的，以便细胞培养和IL-7表达在时间上可以被分开。更具 体来说，在特定实施方案中，IL-7的表达在重组细胞的生长、扩增和/或培养期间可以被抑 制或最小化，以允许生产大量的重组宿主细胞而不带来任何IL-7介导的潜在毒性效应。然 后，可以在细胞培养物(或其样品）中诱导IL-7的表达，以允许有效合成和释放重组IL-7。
[0243] 因此，本发明的一个目标还在于生产重组IL-7多肽的方法，包括培养上面公开的 含有为该IL-7多肽编码的核酸分子的重组宿主细胞和回收产生的重组IL-7多肽，其中该核 酸分子为该IL-7多肽提供了被调控或可诱导的表达，以便该IL-7多肽的表达在重组细胞生 长期间可以被抑制或最小化，在生产期中可以被诱导。核酸典型地含有可诱导的启动子，它 在存在或不存在包含或添加到培养基中的特定试剂的情况下可以被抑制或激活。该方法特 别适合于生产上面公开的IL-7超糖基化构象异构体。
[0244] 在本技术领域中已经公开了多种被调控的或可诱导的表达系统，它们可以在哺乳 动物宿主细胞中起作用，可以用于本发明。这包括四环素 TetOn/Off系统、使用 Mifepristone作为诱导剂和GAL4-Elb启动子的Geneswitch系统（Invitrogen)、Ecdysone系 统（用昆虫类固醇激素的类似物松甾酮A或muristerone A诱导）（Invitrogen)、金属硫蛋白 启动子（用锌诱导）、雌二醇系统、RU486系统、聚焦超声系统、AIR(乙醛诱导的调控)诱导的 表达系统、(^1111^丨6系统(( >)-1]^丨6;(>)13；[0〖611)、06-]^01系统等。这些被调控或可诱导的表达系 统可以用于各种细胞，例如HEK293、HEK293EBNA、HEK、T-REX?-293、T-REX?-HeLa、T-REX?-CH0或T-REX?-Jurkat细胞株，它们用被设计为诱导后表达IL-7的重组载体来转化。
[0245] 此外，瞬时转染可以被用于分离细胞扩增和IL-7生产。在这一点上，有效的基因投 送载体被用于在其扩增后将IL-7编码序列导入细胞中。更优选，用于瞬时转染的载体系统 是病毒载体，例如重组腺病毒或游离的载体[例如pCEPH(Invitrogene)、pTT(IRB:Durocher Y.等Nucl. Acids. Res.，2002,30(2))或使用MAR序列]。腺病毒（以及其它病毒载体例如 AAVs)可以根据本技术领域现有的技术来生产。典型来说，E1-缺陷的腺病毒在E1补充的细 胞株中，例如HEK293、PERC6细胞等中生产。这样的瞬时转染方法可以在培养物中的各种哺 乳动物细胞中进行，例如A549-、HeLa-、VER0-、BHK-或CH0-转化细胞(正如在实施例A4中公 开的那样）。另一种适合于使用在本发明中的瞬时表达方法是例如在下面的文章中公开的 方法:Durocher Y·等Nucl · Acids · Res ·，2002，30(2)，表达在HEK293EBNA或HEK293细胞中。
[0246] 在优选实施方案中，本发明的生产方法包括附加的步骤c)，即对包含在获得的产 物中的上述特定的超糖基化IL-7多肽进行定性和测量或定量。所需的超糖基化的IL-7多肽 的物理和生物学性质可以通过质谱(MALDI-T0F或电喷射）、红外波谱、核磁共振(NMR)、通过 测量圆二色性、通过在特定的生物测试中评估IL-7的生物学活性、通过测量对针对该超糖 基化IL-7多肽产生的特异性单克隆抗体的亲和性、或肝素亲和性HPLC来获得。一旦定性之 后，该构象异构体的定量可以通过ELISA、生物测试、该超糖基化IL-7多肽与IL-7受体的亲 和性和任何应用于分离的构象异构体的蛋白定量方法来进行。
[0247] 在这一方面，本发明还提供和涉及了鉴定和/或测量样品中、特别是药物制剂中的 超糖基化IL-7多肽和/或相关杂质的量的方法。这种定性方法可以在药物批次的质量控制 中用于申报治疗应用的蛋白的最初的性质和质量的研究。本发明第一次提出了含有IL-7的 制剂的定性和控制方法，以确定本发明的超糖基化的IL-7多肽的存在和/或相对数量。优选 的方法使用二辛可宁酸(BCA)蛋白分析、SDS-PAGE、western印迹、孔径排阻HPLC、反向HPLC、 离子交换HPLC、疏水相互作用HPLC、氨基酸分析(AAA)、等电聚焦（IEF)、ELISA、UV吸收和/或 生物分析方法。这些方法可以单独使用，也可以以不同方式组合使用。
[0248] 本发明还提供了生产IL-7药物物质或药物组合物的方法，该方法包括（i)培养编 码IL-7多肽的重组宿主细胞，（ii)分离该重组多肽以生产IL-7药物物质和(iii)调制该IL-7药物物质以生产适合于治疗或疫苗应用的药物组合物，该方法还包括在该药物物质或药 物组合物中鉴定、定性或测量上面定义的超糖基化IL-7多肽的数量和/或质量的步骤，以及 更优选情况下，选择含有超过大约90 %、优选95 %、更优选98 %的作为活性成分的该超糖基 化IL-7多肽的药物物质或药物组合物的步骤。
[0249] 定性步骤可以通过各种技术来进行，更优选通过伴随使用或不使用胰蛋白酶消化 的与质谱相关的方法、外源凝集素亲和层析、氨基酸分析(AAA)、内切和外切N-或0-聚糖酶 消化(PNGase A/F，0-糖苷酶，神经氨酸酶）、荧光团辅助的糖电泳、MALDI T0F或电喷射质 谱、用于二硫桥和/或构象定性的特异性单克隆抗体分析。分子变异体和与产物相关的杂质 的鉴定优选通过使用一种或几种从下面的方法中选择的方法来进行:对于脱酰胺形式，采 用二维电泳、等电聚焦和离子交换层析;对于多聚体形式，采用孔径排阻层析和SDS-PAGE分 析，以及对于截短形式，采用带有或不带酶法预消化的反向HPLC。
[0250] 该步骤特别适合于临床或药物组合物的质量控制，其中只有含有超过大约95%、 优选超过大约96%、98%或99.5%的上述超糖基化IL-7多肽的组合物被保留。所有这些超 糖基化的IL-7多肽显示出低于6.5的平均等电点。
[0251 ]本发明的另一个目标涉及使用通过上面描述的方法获得的重组超糖基化IL-7多 肽，用于生产预防或治疗与免疫缺陷有关的疾病、特别是诱导延长的淋巴细胞生成刺激、弓丨 起和/或扩增免疫反应、特别是抗原特异性免疫反应的药物组合物。
[0252] 本发明的另一个目标涉及使用超糖基化的IL-7多肽，用于在兽医应用领域中在哺 乳动物中用作实验工具和药物应用。
[0253] 本发明的其它特点和优点将在下面的实施例中描述，这应该被当作是说明性的， 不对本申请的范围构成限制。 实施例
[0254] 实施例A.最适化的人类(h)和猿类(s)IL_7编码序列在哺乳动物细胞中的构建和 表达
[0255] A1.最适化的人类IL-7编码核苷酸序列的构建:
[0256] 1.1.肽信号的最适化:
[0257] 因为在5'末端连接了天然IL-7肽信号的IL_7cDNA片段的表达非常低，我们试验了 几个信号肽序列。
[0258] 新的编码人类IL-7的cDNA序列从装配的合成寡聚核苷酸化学获得。
[0259]测试了几个信号肽序列：高度分泌蛋白的信号肽（SP) (Barash等；2002; Biochemical and Biophysical Research Communications 294:835-842):
[0260] IL-7SP
[0261] MFHVSFRYIF GLPPLILVLL PVASS (SEQ ID NO:13)
[0262] ΕΡ0 SP
[0263] MGVHECPAWL WLLLSLLSLP LGLPVLG (SEQ ID NO:14)
[0264] SEAP SP
[0265] MLLLLLLLGL RLQLSLG (SEQ ID NO:15)
[0266] IgG SP
[0267] METDTLLLWV LLLWVPGSTG (SEQ ID NO:16)
[0268] 乳转铁蛋白/玻璃粘连蛋白SP
[0269] MKLVFLVLLF LGALGVALA (SEQ ID NO:17)
[0270] 抑半胱氨蛋白酶蛋白bis SP
[0271] MARPLCTLLL LMATLAVALA (SEQ ID NO:18)
[0272] EP0/IL-7 的新杂合体 SP
[0273] MGVHECPAWL WLLLSLLSLV LLPVAS (SEQ ID NO:19)
[0274] 获得的cDNAs序列被插入到pTT5载体中（Durocher等；2002 ;Nucl · Ac · Res · ; 30)，用 于在哺乳动物细胞例如HEK293细胞、CH0细胞中瞬时表达。
[0275] 为了确定信号肽的良好切割，每个获得的蛋白的N-末端氨基酸被测定;hIL-7的完 整性被维持。
[0276]抑半胱氨蛋白酶蛋白、IgG、EP0和杂合体EP/7表现为是最好的信号肽序列。事实 上，hIL-7的表达被增强了至