糖基化的il-7，制备及应用
【专利说明】糖基化的丨L-7,制备及应用
[00011 本申请是申请日为2006年7月19日、申请号为200680026503. X、发明名称为"糖基 化的IL-7，制备及应用"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及新的改进的白介素-7多肽，以及含有它的组合物及其制备和应用。更 具体来说，本发明涉及具有改进的性质的超糖基化的IL-7多肽，以及它们的生产和治疗应 用。本发明还公开了新的具有修饰的含有人工产生的糖基化位点的氨基酸序列的IL-7多 肽，以及相应的核酸分子、载体和重组宿主或宿主细胞。本发明还涉及了使用这样的多肽、 细胞或核酸用来治愈性或预防性治疗哺乳动物受试者，包括人类受试者。
[0003] 发明背景
[0004] B和T淋巴细胞是免疫反应的主要效应细胞。这两类细胞被认为最终都是从哺乳动 物骨髓中的造血干细胞通过代表每种类别细胞的分化过程中不同的阶段的祖细胞或前体 细胞衍生而来的。成熟的T细胞主要在胸腺中发育，可能是由在T淋巴细胞发育的早期从骨 髓迀移到胸腺的前体细胞发育而来的。淋巴样细胞的发育依赖于各种基质细胞产生的生 长、存活和分化因子。有大量因子对成熟的外周B和T细胞有活性，包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、γ -干扰素、BSF-2、神经白细胞素、转化生长因子β和IL-7。
[0005] "白介素 -7"或"IL-7"是指哺乳动物内源分泌的糖蛋白，能够诱导骨髓衍生的淋巴 细胞祖细胞和前体细胞、包括被称为前B细胞的特化的前体细胞的增殖。尽管最初是从骨髓 细胞株的基质成分衍生而来的，但IL-7也被胸腺基质细胞、肠和其它上皮细胞、某些树突状 细胞和滤泡树突状细胞、角质细胞和基本上所有的淋巴样组织所分泌。这种蛋白的另一种 命名是"前B细胞生长因子"和"淋巴细胞生成素-Γ。
[0006] EP0314415(或US 4,965，195)描述了哺乳动物白介素-7蛋白和相应的0财8。人类 IL-7的氨基酸序列包含三个推测的N-连接的糖基化位点，位于70、91和116位的Asn残基上。 hIL-7(人类IL-7)在C0S细胞中的瞬时重组表达使得r-huIL-7(重组人类IL-7)可以被观察 到为表观分子量大约为20、24和281<1^的三个蛋白条带（(]〇81]^11等，1^1]^)11〇1<:;[116 1?606口1:01 Interactions ; 1989; 179 : 229-236) AIL-7在BHK细胞中的稳定重组表达也已经被报道 (Armitage等；The Journal of Immunology; 1990; 144:938-941)。但是，天然存在的人类 IL-7的糖基化状态、特别是0-糖基化状态还从来没有被记录或研究过，并且糖基化情况对 IL-7性质的影响也从来没有被考虑过。此外，正如在EP0314415中描述的那样，在大肠杆菌 中产生的未糖基化的成熟的人类IL-7(r-hIL-7)，表现出17,387道尔顿的分子量，在体外在 基于各种淋巴细胞种群的增殖的特定的生物分析中显示出高的活性。其它的细胞因子和生 长因子例如G-CSF、GM-CSF、IFN、HGF等，没有糖基化时也表现出完整的治疗活性。
[0007] W02004/018681公开了人类IL-7的一种活性构象异构体，包含了下列二硫桥：1-4 (C2-C92)、2-5(C34-C129)和3-6(C47-C141)，并公开了生产方法或研究其特征的方法及其 应用。
[0008] IL-7最初是作为细胞因子被公开的，其主要活性是诱导前体B细胞的增殖(Namen A.E.等；Journal of Experimental medicine;1988;167:988_1002)。最近已经报道IL-7在 T细胞发育的早期阶段参与了胸腺细胞(T-细胞）的存活和增殖(Schluns K.S.等;Nature Immunology;2000; 1 (5):426-432)。IL-7途径对于淋巴细胞发育、特别是发育为胸腺细胞是 重要的（Maeurer M. J.等；Int ·Rev. Immunol ·; 1998; 16: 309_22_Fry T· J.等；Blood; 2002; 99:3892-904) Try及合作者还鉴定出IL-7在多因子作用中作为不依赖胸腺的T-细胞再生 的潜在调节剂（（Fry T.J.等.；Bl〇〇d;2001 ;97(6) :1525-1533) JL-7有力地调节成熟的Τ细 胞，并且除了对成熟T-细胞的这种效应之外，IL-7还可以影响抗原呈递细胞的发育 (Marquez C ?等；J ·Exp ·Med ·; 1995; 181:475-83)。IL-7对于CD4+和CD8+亚类的记忆T细胞的 再生也是重要的（Kondrack R.M?等；J.Exp.Med. ;2003; 198:1797-806-Kaech S.M?等； Nat. Immunol·;2003;4:1191-8)。
[0009] 因此，IL-7具有极大的治疗潜力，可以用于刺激T细胞前体、分泌抗体的B细胞的增 殖，用于刺激抗原驱动的T-细胞外周扩增，用于生产幼稚T细胞以及其它造血细胞类型。活 性IL-7分子的一种特别有趣的治疗应用是用于淋巴细胞减少的病人的免疫重建，这样的病 人包括癌症治疗病人、接受骨髓或干细胞移植的病人、表现出获得性或遗传免疫缺陷的病 人、老年病人或任何具有低CD4计数的病人。由于IL-7具有产生新的幼稚CD4T-细胞以及扩 增特定的库以产生或增加特异性免疫反应(疫苗增强）的能力，它在这些方面还有其它的应 用。
[0010] 鉴于其治疗潜力，对于开发适合于有效的治疗应用的生物活性或改进的IL-7多肽 有相当大的兴趣。就这点而言，在可以商业获得的各种细胞因子和生长因子中，有些是低免 疫原性的（例如α-干扰素"IFNa"，粒细胞集落刺激因子"G-CSF"），以便相应的药物物质不需 要超过通常接受的重组蛋白常规水平的非常特定的多肽纯度。相反，其它的生长因子具有 更高的免疫原性(例如干扰素"β-IFN"，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子"GM-CSF"），或它们 比活性对于生命来说非常重要(例如红细胞生成素，"ΕΡ0"），以至于药物物质多肽的纯度和 分布情况必须被特别地研究并维持在狭窄的限度内，以保护免受免疫原性的影响。
[0011] IL-7是独特的分子。由于其内在的免疫增强性质，用作治疗药剂的IL-7特别易于 触发抗IL-7的免疫原性(抗IL-7的结合或中和抗体）。这种免疫原性对于蛋白的长期治疗活 性是有害的。抗IL-7抗体可以修饰IL-7的药物动力学，并中和其治疗活性。
[0012]有多种IL-7同工型参与触发抗IL-7的免疫原性，其中包括:改变的多肽序列（例如 氧化、还原、脱酰胺基的或截短的形式）、共价的或非共价的IL-7多聚体、例如聚集的IL-7分 子等。因此，关键的是确定更稳定的、更不易于分子间聚集的、更少免疫原性的、但仍然具有 生物学活性的IL-7多肽和药物物质。事实上，尽管大多数药物的活性与AUC参数相关，但IL-7的活性与半衰期参数、更具体来说是平均存留时间相关。
[0013] 发明简述
[0014] 本发明公开了新的、改进的IL-7多肽、药物物质和组合物。更具体来说，本发明公 开了新的IL-7分子种类，它具有高程度的糖基化，寡糖分布情况移向较高的分子大小，碳水 化合物基团上带有增加的唾液酸化和岩藻糖基化，并具有较低的等电点。本发明显示出这 些新的寡糖分布情况给这些新的药物物质赋予了改进的化学和药物学稳定性，以及在体内 使用后延长的药物动力学分布情况，其特征为增加的平均存留时间(MRT)，这允许以较低的 频率计划剂量给药。
[0015] 因此，本发明提供了新的高度糖基化或超糖基化的、具有改进的性质的IL-7多肽。 本发明还公开了新的具有修饰的氨基酸序列的IL-7多肽，其中包含了人工产生的糖基化位 点，以及公开了相应的核酸分子、载体和重组宿主或宿主细胞。本发明还涉及使用这些多 肽、细胞或核酸用于哺乳动物受试者、包括人类受试者的治疗性或预防性治疗。因此，本发 明公开了新的活性IL-7多肽、药物物质和药物组合物，它们表现出增加的稳定性、对蛋白水 解和聚集的减少的敏感性、利于体内的长期活性以及减少的免疫原性，从而允许在哺乳动 物受试者中产生改进的全面的或特异性免疫反应。
[0016] 本发明的一个目标在于超糖基化的IL-7组合物。
[0017] 本发明的另一个目标在于纯化的超糖基化的IL-7多肽。
[0018] 这种超糖基化的IL-7多肽含有至少三个N-糖基化氨基酸残基。
[0019] 本发明的另一个目标涉及使用超糖基化的IL-7用于制造由该超糖基化的IL-7和 可药用的赋形剂或载体组成的药物，用于治疗哺乳动物受试者。
[0020] 本发明的另一个目标涉及使用超糖基化的IL-7组合物用于制造药物，以治疗哺乳 动物受试者。
[0021] 本发明的另一个目标是在受试者中引起或刺激免疫反应的方法，包括给受试者使 用有效量的超糖基化的IL-7组合物。
[0022] 本发明的另一个目标是离体(ex-vi vo)增强T细胞的扩增的方法，该方法包括将T 细胞与超糖基化的IL-7多肽或组合物相接触，从而增强T细胞的扩增。
[0023]在具体的实施方案中，超糖基化的IL-7组合物是含有至少80 %、优选在80 %和 95%之间的IL-7多肽的组合物，所述多肽在至少三个不同的氨基酸残基上被糖基化的。这 些残基可以是天然存在于IL-7多肽序列中，也/或可以是人工产生的糖基化位点。
[0024]在另一个具体的实施方案中，超糖基化的IL-7组合物是含有至少80%、优选在 80 %和95 %之间的IL-7多肽的组合物，所述多肽在从三到八个不同的氨基酸残基上被糖基 化的，其中的糖基化位点包括一个0-和最多七个N-糖基化位点。这些残基可以是天然存在 于IL-7多肽序列中，也/或可以是人工产生的N-糖基化位点。
[0025]在这方面，本发明的另一个目标涉及具有修饰的氨基酸序列的IL-7多肽，其中该 序列含有至少一个人工产生的糖基化位点。根据特定的实施方案，本发明的IL-7多肽含有 1、2、3或4个人工产生的糖基化位点，更优选为1、2或3个;更优选为1或2个。正如将被进一步 公开的那样，人工产生的糖基化位点优选为N-连接的糖基化位点。本发明的IL-7多肽可以 来自任何哺乳动物来源，特别是人类来源。此外，这样的IL-7多肽可以包含成熟的IL-7多肽 的序列，或者进一步含有其它的氨基酸残基，例如分泌肽。此外，或者可选的，IL-7多肽优选 是包含下列三个二硫桥的特定的构象异构体:Cy S:l-4(CyS2-CyS92);2-5(CyS34-Cy S129); 3-6(Cys47-Cysl41)。这样的修饰的IL-7多肽的具体的例子含有至少一个在后面的表1中公 开的氨基酸修饰，或是它们的组合。
[0026]本发明的另一个目标在于编码上面讨论的IL-7多肽的核酸分子。核酸分子可以是 任何DNA或RNA分子，典型为cDNA分子。
[0027]本发明的另一个目标在于编码分泌信号、包含SEQ ID N0:19的核酸分子。
[0028]本发明的另一个目标在于含有上面定义的核酸分子的载体。载体可以是任何原核 或真核载体，典型为真核载体，可以从质粒、染色体外DNA、粘粒、病毒载体、人工染色体等中 选择。载体可以含有任何允许编码的核酸在选定的宿主细胞中适当表达的调节序列，例如 启动子、终止子、polyA、复制原点、同源区域、内含子、基因的5'或3'非翻译区域(UTR)等。
[0029] 上述的核酸和载体可以用于例如在各种感受态宿主细胞中生产重组的哺乳动物 IL-7多肽，以及用于基因治疗目的。
[0030] 本发明的另一个目标在于含有上面公开的核酸或载体的重组宿主细胞。这样的重 组细胞可以是原核的，也可以是、并且是更优选的是真核的，例如酵母、昆虫、植物或哺乳动 物细胞，例如，更优选情况下，被转化以表达或过量表达例如来自人类来源的糖基转移酶 和/或2-6-唾液酸转移酶基因的重组宿主细胞。
[0031] 本发明的另一个目标在于含有上面描述的IL-7多肽、典型为超糖基化的IL-7多肽 的药物物质。更优选情况下，药物物质含有少于大约10%的无糖基化或单糖基化的IL-7多 肽，和/或基本上不含有与产物相关的杂质。
[0032] 本发明还涉及使用上述的药物物质来制造药物（"药物产品"）或药物组合物。
[0033] 本发明还涉及含有有效量的上述IL-7多肽或组合物或药物物质以及一种或多种 药物相容载体或赋形剂的药物组合物。
[0034] 本发明还提供了能够与上面定义的IL-7多肽发生特异性免疫反应的抗体及其片 段或衍生物、产生该抗体的杂交瘤细胞系、以及含有该抗体及其片段或衍生物的适合用于 诊断、分析测试或治疗的组合物。
[0035]本发明的另一方面是从原核或真核宿主细胞生产上述的IL-7多肽的方法，以及检 测或测量这样的IL-7多肽在样品中的存在的方法，或对样品定性的方法。
[0036]在具体的情况下，生产上述的IL-7多肽的方法包括：
[0037] a)培养上述的重组宿主细胞，以及 [0038] b)收集从该细胞产生的IL-7多肽。
[0039] 按照优选实施方案，在允许有效的糖基化基序，特别是唾液酸残基被加到IL-7多 肽的条件下进行表达。
[0040] 在另一个优选实施方案中，在维持细胞在指数生长末期的分批补料培养或灌注状 态下进行生产。这样的条件提高了翻译后修饰的质量，有助于每个IL-7多肽的较高程度的 唾液酸化。按照具体的实施方案，编码核酸含有分泌信号和/或最适化的核酸序列，和/或宿 主细胞是真核宿主细胞(例如哺乳动物或昆虫或酵母细胞）。
[0041] 本发明的另一个目标涉及使用上面定义的或通过上述方法获得的IL-7多肽或超 糖基化的IL-7组合物，用于生产能够在受试者中引起或调节免疫反应、特别是诱导延长的 淋巴细胞生成刺激和/或放大免疫反应的药物组合物。
[0042] 本发明还涉及使用上面定义的或通过上述方法获得的IL-7多肽，用于生产防止或 治疗与免疫缺陷有关的疾病的药物组合物。
[0043]正如将在下面讨论的那样，本发明的多肽表现出了延长的血浆半衰期和平均存留 时间，这有利于体内受体相互作用和活性、和/或改进的稳定性和/或较低的长期免疫原性， 从而允许它们用于在哺乳动物受试者、特别是人类受试者中治疗各种病理状况。
【附图说明】
[0044] 图1:质粒 ph-pgk.EP7-hIL-7:
[0045] efla pA: "延伸因子la"p〇ly A序列;hgh pA: "人类生长激素 "poly A序列；SpA:合 成的polyA序列;hph:潮霉素抗性;Amp:氨苄青霉素抗性;MAR rabbits珠蛋白：推测的兔β珠 蛋白（基质结合区）；pr.Tk:胸苷激酶启动子;sv40enh. :sv40增强子;pr pgk:磷酸甘油酯激 酶启动子；5 ' UTRint 1:含有嵌合的内含子(hB珠蛋白-免疫球蛋白）的5 '非翻译区；EP7-hIL7:上游含有EP7信号肽的最适化的人类IL-7cDNA。
[0046] 图2:质粒 pBh-pgk.EP7-hIL-7:
[0047] Bcl2:Bcl2cDNA; IRES:内部核糖体插入位点
[0048]图3:在生物反应器中培养1天(D1)到10天(D10)的哺乳动物细胞中重组hIL-7的表 达，细胞内的与分泌的IL-7的Westen印迹比较
[0049] 图4:在整个纯化过程中rec-hIL-7糖基化形式的层析分级分离：不同洗脱级份 (B1-B10)中蛋白含量的SDS PAGE分析。IL-7糖基化形式在捕获和HIC步骤中被分离。使用缓 冲液梯度以按照它们轻微不同的物理化学性质分别洗脱hIL-7的糖基化形式。对足够级份 的分级分离以及随后的选择允许富集全部三种糖基化的重组hIL-7(3N-或2N-以及10-糖基 团）。丽M，蛋白分子量标准（10 ;15;20;25;37;50 ;75;100;150;250kDa);Bl-B10,洗脱级份； B1-B4,留下来用于进一步纯化的洗脱级份；CT，从用同样的最适化的hIL-7cDNA转染的 HEK293细胞株的培养物获得的级份B1。
[0050] 图5:纯化的重组hIL-7在SDS PAGE上的分析。纯化的重组hIL-7的样品在还原条件 下被上样SDS PAGE。凝胶通过下列方法显示：
[0051 ] A ·考马斯染色
[0052] B.Western 印迹
[0053] MWM:分子量标准（10; 15; 20; 25 ; 37 ; 50; 75; 100 ; 150; 250kDa)。1道：HG-37-147 ; 2 道:HG-40-104; 3道:HG-hIL-7;4道:E· coli hIL-7。
[0054] 图6:纯化的糖基化rec-hIL-7产物的SDS-PAGE表观分子量的比较。
[0055] Μ道=分子量标准，1道= Namen等在专利#US 5 328 988中描述的纯化产物（大约 25KDa)的示意图，2道=申请者纯化的CHO rec-sIL-7产物，3道=申请者纯化的CHO rec-hIL-7产物，4道= hIL-7 IN-和2N-糖基化形式作为表观分子量比较的标准，5道=申请者纯 化的大肠杆菌rec-hIL-7产物(CYT 99 007)。
[0056]图7:纯化的重组人类IL-7在脱糖基化后在还原条件下在SDS PAGE上的分析。
[0057]纯化的重组糖基化人类IL-7样品用PNGase F消化:从2分钟到24小时的动力学样 品上样在凝胶上。
[0058]另一个样品（00/N)用PNGase F+0-糖苷酶/(1-4)半乳糖苷酶/神经氨酸酶/N-乙酰 氨基葡糖苷酶消化24小时以上。
[0059] 糖基化人类IL-7和大肠杆菌人类IL-7作为对照上样在凝胶上。
[0060] 然后将3糾10、2糾10、謂+10、10糖基化形式和脱糖基化的人类几7按照它们估计的 MW在凝胶上分离，分别为33、27、24、18和171^)&。
[0061 ]图8:不同的纯化的rec-hIL-7糖基化形式的质谱分析。
[0062] -23kDa(23179Da):Rec-hIL-7(CH0 S，2N+3N)
[0063] -25kDa(25127Da):Rec-hIL-7(CH0 S，3N)
[0064] 图9:纯化的重组超糖基化的人类IL-7多肽的二维电泳分析。在等电聚焦(pH范围 3-10)之后，糖基化的形式在还原条件下在SDS PAGE上分离(考马斯亮蓝染色）。
[0065]图10:重组的hIL-7N-聚糖复杂性的质谱分析。纯化的糖基化的hIL-7样品用内切 糖苷酶例如肽-N-糖苷酶(PNGaseF，Roche)进行酶法消化。酶法消化释放的N-连接的寡糖、 释放的蛋白样品从肽结构上分离出来，通过MALDI-T0F质谱进行分析。在国际数据库中搜索 相应每个峰的m/z值，这允许准确地鉴定hIL-7分子上的N-聚糖的名单。
[0066]图11:在重组hIL-7上使用特异性外源凝集素（外源凝集素印迹)研究0-聚糖的性 质。在分离蛋白样品并与转印到膜上之后，使用两种外源凝集素（MAA，来自Maackia amurensis;PNA，来自Arachis hypogea)中的任何一种来显示产物。1道:标准蛋白