少10倍。
[0277] 1.2.编码人类IL-7的核苷酸序列的最适化:
[0278]为了维持EP/7hIL_7的氨基酸序列，核酸序列进行了如下最适化
[0279]-消除了人类稀有密码子（使用图形密码子使用分析者软件Graphical Codon Usage Analyser software)
[0280] -通过增加除了信号肽序列之外的序列的"Gf含量并最小化连续的"CA"二核苷酸 以增强mRNA的稳定性(Kim等；1997;Gene; 199)。
[0281] 序列被描述在SEQ ID N0:2中。
[0282] A2.最适化的编码猿类IL-7的核苷酸序列的构建:
[0283] 正如在编码人类IL-7的序列中描述的那样，合成了EP/7-SIL-7最适化序列（SEQ ID N0:3)〇
[0284] A3.编码犬类IL-7的核苷酸序列的构建:
[0285] 犬类IL-7cDNA通过PCR从狗肾cDNA文库(Biochain)中扩增，按照上述人类IL-7编 码序列中那样进行克隆和测序，IL-7SP或EP/7SP-CIL-7序列被合成(SEQ ID N0:6)。
[0286] A4.哺乳动物表达(BHK细胞表达，或CH0细胞表达或HEK-293细胞表达）:
[0287] 编码IL-7的cDNA序列通过聚合酶链反应(PCR)扩增(Mullis等；1987;Methods in Enzymology; 155:335-350)以产生限制性位点(NotI/Swal)，用于克隆在表达载体中。
[0288] 设计了表达系统ph-pgk · EP7-hIL-7 (图 1)或pBh-pgk · EP7-hIL-7 (图 2)以表达从天 然人类IL-7基因序列翻译而预测的IL-7蛋白。在载体上携带的抗生素(在大肠杆菌中克隆 使用氨苄青霉素，在哺乳动物细胞中表达使用潮霉素)抗性标记物基因的基础上来筛选含 有重组载体的细胞。
[0289]该表达载体已经被完全构建在CYTHERIS中，开始于赋予系统氨苄青霉素抗性的 PIC20H质粒(ATCC)。它含有2个哺乳动物的生产单元：
[0290] 1/-个用于表达IL-7编码序列，该序列在pgk启动子控制之下，带有合成的polyA 序列以避免转录通过pgk启动子。
[0291] 2/-个用于表达潮霉素抗性，在"sv40增强子-tk启动子"控制之下。
[0292] 下列序列被插入到该最初的载体中：
[0293] -"hph-efla pA" ：HindIII/SbfI片段，来自pVitro2.mcs(Invitrogen);
[0294] -tk启动子:EcoRI/HindIII PCR片段，来自pMEP4(Invitrogen);
[0295] -sv40增强子：BssHII/EcoRI PCR片段，来自pVitro2.mcs(Invitrogen);
[0296] -MAR兔β珠蛋白：推定的"基质结合区域"，用于在染色质的高度转录区域中更好地 整合，来自pSG5(Stratagene)的EcoRV/Agel兔β珠蛋白内含子2PCR片段；
[0297] -SpA:StuI/BspEI片段，来自pCAT3对照（Promega);
[0298] -Pgk启动子:KpnI/BssHII PCR片段，来自pQBI .pgk(Q-biogen);
[0299] -5'UTRint 1:HindllI嵌合内含子片段，来自pCAT3-对照(Promega);
[0300] -Notl/Swal或Notl/Pmll IL-7编码cDNA和突变体；
[0301 ] -]^11卩厶：处111/3?^1合成序列，从]\1.6〇〇(11]1&11(〇61^〇1:〇等；1981;仙(31.厶(^(1.1^8.;9 (51 ):3719-3730)描述的人类生长激素 cDNA序列合成。
[0302]载体的某些变异体使用除了pgk启动子之外的其它IL-7启动子来制备：Ef 1α、 snRNA U1、肌动蛋白、泛素、CMV启动子等，或其它选择标记物:新霉素等。
[0303] 含有SEQIDN0:2的哺乳动物(HEK-293、CH0或BHK)表达载体被称为ph-pgk·EP7-hIL-7 或 pBh-pgk · EP7-hIL-7。使用ph-pgk · EP7-hIL-7 或 pBh-pgk · EP7-hIL-7 表达载体，人类 IL-7在HEK-293或CH0转染细胞中得到了稳定的表达。在用Ndel线性化后，使用本领域的专 业技术人员所熟知的方法将表达载体ph-pgk. EP7-hIL-7或pBh-pgk. EP7-hIL-7转染到哺乳 动物宿主细胞中。用于建立稳定的转染子的选择性标记是潮霉素(Invitrogen)。
[0304] A5.可诱导的哺乳动物表达(金属硫蛋白启动子"ΜΤΓ):
[0305] 在同样的表达载体中，用参照PubMed中（No X53530 )(Carter等；1984; Proc.Natl .Acad.Sci.USA;81:7392-7396)的序列化学合成的BspEI/BssHir'小鼠 ΜΤΓ序列 代替了pgk启动子。
[0306] MT1是金属依赖性转录因子启动子。因此稳定的克隆的表达是锌依赖性的。
[0307] A6.IL-7和Bcl2或BclXL(BHK细胞表达、或CH0细胞表达或HEK-293细胞表达）的哺 乳动物共表达：
[0308]为了增加在哺乳动物宿主细胞培养物中的细胞存活率、从而最适化IL-7的生产 量，通过将Bcl2cDNA序列插入到tk启动子和hph cDNA之间制备了变异的表达质粒，以便 B c 1 2的抗凋亡活性可以在生物反应器生产中测试（Z h ο n g等；1 9 9 3 ; Proc.Natl.Acad.Sci.USA;90:4533-4537_Lee等；2000;Journal of cell Science;114 (4):677-684)(参见图 2)。
[0309] 实施例B.编码IL-7的核苷酸序列的超糖基化类似物在哺乳动物细胞中的构建和 表达：
[0310] B1.超糖基化IL-7类似物的cDNA序列的构建
[0311]使用几种技术包括诱变方法获得了超糖基化的IL-7类似物。超糖基化的IL-7类似 物(也称为:HG37-40-104-126和-147)是从装配的合成的寡聚核苷酸化学构建的。通过引入 一个或多个所需的突变获得了几个类似物，这些突变产生了具有一个或多个附加的糖基化 位点的IL-7类似物。因此，在用Notl和Pmll限制性酶消化之后，含有一个或多个所需的附加 的糖基化位点的全长cDNA序列被插入到No11/PmlI限制性位点之间，以直接克隆到表达载 体中（与图1或2相同，但是含有适当的IL-7序列）。
[0312] B2.超糖基化IL-7类似物的cDNA序列的表达
[0313] 超糖基化IL-7类似物的表达与上面A4到A6节中描述的那样进行。
[0314] 实施例C.在生物反应器培养条件下生产重组hIL-7
[0315] 实施例A4中获得的最稳定的阳性克隆通过几次培养基和成分筛选之后适应于无 血清悬浮培养，以便产生最适合在高细胞密度培养中生产和生长的克隆。在接种到1〇〇到 2000L生物反应器中之前，在"波包(wave bag)"系统中进行了预培养。细胞培养在带有灌注 系统或补料分批培养系统的1〇〇到2000升生物反应器中进行10到15天。细胞在添加了植物 蛋白胨的低谷氨酰胺含量的培养基中被扩增到浓度为一千万细胞/ml。
[0316] 在第一个扩增步骤中，培养温度被调节到37°C以增加细胞密度。几天之后，温度被 降低到大约28/32Γ，以抑制细胞生长并允许较好的表达水平。此外，降低温度降低了分泌 途径的速度、有利于被表达的IL-7更好地被糖基化、增加了被占据的位点。
[0317]在培养结束之前几天，通过在培养基中添加〇. 5-1 OmM 丁酸钠促进了 IL-7的表达。
[0318]在上面描述的条件之下，细胞内和培养基中的IL-7表达都被检测（图3)。
[0319]为了生产高分子量的IL-7糖基化形式，在培养过程中在培养基中维持3g/L葡萄糖 和3mM谷氨酰胺，以及好的供氧。人们也检测氨基酸消耗，并在培养基中补加消耗掉的氨基 酸。一旦细胞存活率降低到90%以下，就收获细胞培养物。
[0320] 实施例D.在HEK-293和CH0细胞中表达的重组人类IL-7产物的纯化
[0321] 收集粗细胞培养基，将完整细胞和细胞碎片离心沉淀。此外，这也可以通过在澄清 舱或模块例如Mustang XT舱（Pall)、Sartoclear P(Sartorius)、Millistak+0pticap (Mi 11 ipore)或中空纤维舱(AXH cross flow 10(GE))或等价物上进行深部过滤来达到。被 离心的培养基使用膜截留分子量为10kDa的Centrasette盒式装置(Pall Life Sciences) 浓缩大约10倍以减少上清液体积。任何具有同样孔径的其它过滤/浓缩系统也可以使用。
[0322] 将浓缩的上清液离心，调节到pH 7.5,上样用pH 7.5的50mM磷酸钠平衡的Q Sepharose Fast Flow(General Electric Healthcare)柱。然后在流出液中回收蛋白。在 该负层析步骤中，各种污染物包括DNA被消除。该步骤的一个替代方法是在同样条件下使用 被证实的Mustang Q膜盒(Pall)，以获得更好的收率和/或稍微更快的过程。该步骤的另一 种替代方法是在强阴离子交换树脂（Q Ceramic Hyper D(Biosepra)，Capto Q(GE))或膜 (Sartobind Q，Sartorius)上捕获蛋白。
[0323] 在这个预纯化步骤之后，在强阳离子交换树脂上进行捕获步骤。将在上一步骤结 束时收集到的流出物上样至用载样缓冲液(pH 7.5的50mM磷酸钠)平衡的Fractogel EMD S03-(Merck)柱，然后用pH 7.5的50mM磷酸钠清洗。使用溶解在pH 7.5的50mM磷酸钠中的线 性NaCl梯度（15个柱体积)进行洗脱。
[0324] 将有活性的级份合并，在室温下在pH 3.5中失活30分钟以消除病毒。该方法的一 个替代方法是在步骤末尾时用多层纳滤代替该病毒失活步骤。
[0325] 在病毒失活后，用缓冲液(pH 7的200mM磷酸钠，3M硫酸铵)将合并的蛋白级份稀释 2倍，将pH调整到7。然后，将蛋白溶液上样至用载样缓冲液(pH 7的50mM磷酸钠 +1.5M硫酸 铵)平衡的疏水相互作用(HIC)丁基Toyopearl 650-M(T〇S〇h)柱。在用载样缓冲液清洗后， 用25倍柱体积的溶解在pH7的50mM磷酸钠中从1.5M到0M的硫酸铵盐梯度洗脱IL-7。
[0326] 替代的HIC树脂例如己基Toyopearl 650_M(Tosoh)、丁基/辛基Sepharose?4Fast Flow(General Electric Healthcare)可以被用于该步骤。另一种用于放大生产目的的HIC 替代方法是使用另一种基质例如MEP HyperCeKPall Bios印ra)以获得相似的结果。
[0327] 上述捕获步骤和疏水相互作用层析的组合允许根据本身固有的生理-化学性质最 适地分离不同糖基化的IL-7同种型（图4中显示的从B1到B10)。洗脱级份的适当选择(从B1 到B4级份)导致富集3N-连接而不导致10-糖基化的hIL-7实体。这样的糖基化形式分离的一 个例子被显示在图4中。
[0328] 高度糖基化的IL-7级份被合并，并上样至用低盐缓冲液(pH6的20mM乙酸钠)平衡 的G25Sephadex(General Electric Healthcare)柱。该步骤的替代方法是使用截留分子量 5或lOKDa的TFF膜（Qvick start membranes，（GE)，Centramate TFF(Pall))透滤高盐蛋白 合并液。
[0329] 从G25步骤获得的蛋白级份被上样至用上样缓冲液（pH6的20mM乙酸钠）平衡的 Source 15S(General Electric Healthcare)柱。该精制步骤导致蛋白浓缩和消除残留的 污染物。
[0330]用乙酸钠载样缓冲液冲洗柱子，然后用15倍柱体积的溶解在pH6的20mM乙酸钠中 的从0到1M的NaCl盐梯度洗脱IL-7蛋白。被洗脱的级份通过SDS-PAGE分离，用考马斯亮蓝或 硝酸银染色。只有含有IL-7的级份被合并，以释放出最终的纯化的IL-7蛋白批次产品。 [0331]如果之前没有进行病毒失活，纯化方法还可以包含另外的两种过滤的组合，以确 保最佳的病毒清除。病毒清除可以通过使用预过滤装置（Planova 75，Asahi Kasei Medical)过滤、然后通过纳米孔径的纤维素膜(Planova 20N，Asahi Kasei Medical)或通 过其它的病毒移除膜(Virosart, Sartor ius ;DV20, Mill ipore)过滤来完成。
[0332] 纯化的大肠杆菌、糖基化和超糖基化的hIL-7的SDS-PAGE被显示在图5中。
[0333] 凝胶中的迀移说明的蛋白的糖基化水平。事实上，这里试验的超糖基化形式(HG-37-147和HG-40-104)比全糖基化的hIL-7具有更高的分子量。
[0334] 实施例E.糖蛋白的糖分析
[0335]重组人类IL-7的生产在基于CH0细胞的表达系统中进行，这是因为但不限于下面 的原因。CH0细胞是目前最有效和最常用的用于生产重组人类治疗性糖蛋白的宿主。此外， 有大量详细的工作报道，CH0细胞、包括表达唾液酸基-α-1-6转移酶的遗传修饰的CH0细胞， 能够以与在人类细胞中观察到的在量上相同的方式对重组蛋白进行糖基化。这种具体的特 点对于重组糖蛋白在注射到人类病人中时减少潜在的免疫原性是非常重要的。
[0336] 从转染的CH0细胞获得的富集了特定糖基化形式(3N或3N+2N，带有或不带有1个0-聚糖基团）的纯化的重组人类IL-7产物或级份通过Western印迹进行分析，以证实与大肠杆 菌来源的重组人类IL-7相比的糖基化状态。
[0337] CH0产生的纯化的IL-7的不同糖基化形式使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行差异定 性。糖蛋白实体的表观分子量范围在20KDa和35KDa之间，主要带位于大约27KDa(在SDS-PAGE上观察到的，参见图5和图6)，最可能对应于带有或不带有1个0-聚糖基团的3个N-糖基 化的形式。这种特点被纯化的产物的酶法脱糖基化所特异性阐明（参见图7)。
[0338] CH0产生的纯化的IL-7的这些糖基化形式(3N或3N+2N，带有或不带有1个0-聚糖基 团）使用质谱进行了差异定性，得到的带有或不带有1个〇-聚糖基团的3N-糖基化形式的分 子质量大于25KDa，带有或不带有1个0-聚糖基团的2N-糖基化形式的分子质量大于23KDa (参见图8)。
[0339] 此外，上述的糖基化形式的平均等电点为5.8,反映出高唾液酸化情况(参见图9)。
[0340] 作为对照，对未糖基化的大肠杆菌来源的hIL-7进行了同样的分析，得出的蛋白的 表观分子量为大约18KDa，哺乳动物细胞来源的超糖基化的hIL-7表面出的表观分子量在27 至lj37KDa之间。
[0341] 通过完全酶法脱糖基化然后层析分离并用质谱分析产生的寡糖，对纯化的CH0来 源的hIL-7的总糖基化复杂性和总N-聚糖不均匀性进行了评估。
[0342] 纯化的糖基化的h-IL-7样品用内切糖苷酶例如肽-N-糖苷酶F(PNGaseF，R〇Che)进 行酶法消化。释放出的?^-连接的寡糖使用8瓜口11；^6〇31'13〇8瓜口1120〇-30(^1柱子(41]^6(311) 从肽结构上分离并分拣，然后进行MALDI-T0F质谱分析（Voyager Spec, Applied Biosystems)。对应于MS谱图的每个峰的m/z值允许鉴定完整hIL-7分子的N-聚糖通用结构。
[0343] 为了特异性检测含有唾液酸的聚糖，在质谱分析之前进行PNGase产生的寡糖的羧 甲基化(如同在Powell AK&Harvey DJ，Rap.Com.Mass Spec. 1996中报道的那样）。
[0344] 对从纯化的CH0来源的hIL-7产生的谱图进行的分析显示出N-聚糖的质量范围从 1340Da直到最大3516Da(参见图10)。
[0345] 根据谱图，可以确定下面的聚糖结构(参见表3):
[0346] 表 3
[0347] 1234
2 Hex:己糖（半乳糖或甘露糖），HeXNAC:N-乙酰己糖肢（N-乙酰匍萄糖肢或N-乙酰半 乳糖胺），dHex:脱氧己糖(果糖），Sulph:硫酸基团，NeuAc:N-乙酰神经氨酸。 3 考虑到i)观察到的寡糖基团的相应质量，ii)每个单糖的质量和iii)目前已经了 解的聚糖生物合成途径的法则，可以具有高度可能性地推断下列高复杂性的N-聚糖结构。 4 表4:在CH0来源的hIL_7(但不限于此）上定性的复杂的二和三天线哺乳动物N-聚 糖：
[0352]
[0353] ?甘露糖DN-乙酰葡萄糖胺?半乳糖果糖Λ唾液酸
[0354] 糖基化复杂性也通过确定在纯化的CH0来源的hIL-7的所有聚糖（如果可用的话， N-和0-聚糖)上发现的不同单糖的摩尔比率来评估。
[0355] 纯化的糖基化h-IL-7样品的所有聚糖通过甲醇分解反应进行化学处理，以便水解 糖之间的所有糖苷连接。使用偶联的气相色谱-质谱自动质量装置(Finnigan)将释放的单 糖从肽结构上分离并分拣。参照已知的内标和经典的哺乳动物N-聚糖的3甘露糖含量确定 摩尔比率。
[0356] 这样的分析对CH0来源的h IL-7给出了下列摩尔比率：
[0357] 表 5
[0358]
[0359] ^CH0来源的hIL-7的位点特异性N-聚糖模式不均匀性通过内切蛋白酶消化、然后对 产生的肽进行分级和质谱分析来测试。
[0360]纯化的样品用胰蛋白酶或其它内切蛋白酶进行消化，以产生对应于表达的IL-7的 每个N-糖基化位点的糖肽。每个糖肽进行N-末端微量测序，通过当用反向HPLC进行分析时 它的特定持留时间来鉴定。因此将每个糖肽从其它糖肽中纯化出来。糖肽带有的N-聚糖的 不均勾性通过MALDI-TOF MS(Q Star,Applied Biosystems)进行分析。对应于MS谱图的每 个峰的m/z值允许鉴定hIL-7的指定位点的N-聚糖形式。
[0361] 0-糖基化通过使用0-聚糖特异性外源凝集素（外源凝集素印迹，参见图11)来分 析。
[0362] 纯化的CH0来源的hIL-7样品通过SDS-PAGE分析进行分离，并转印到PVDF膜上。固 定化的蛋白用（但不限于）过氧化物酶标记的PNA(花生凝集素）和/或MAA(Maackia amurensis凝集素)探测并染色以可视化。
[0363] 聚糖的不均匀性和组成也通过使用外源凝集素与纯化的CH0来源的hIL-7的亲和 性来确定。
[0364] -系列对N-和0-聚糖结构具有亲和性的外源凝集素被选择用于包被96孔微