QLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQffLTEAEQFLRKTQIPENffEHAKYKffYLKELQDGIGQRQ TVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQKNILSEFQRDLNEFVLWLEEADNI ASIPLEPGKEQQLKEKLEQVKLLVEELPLRQGILKQLNETGGPVLVSAPISPEEQDKLENKLKQTNLQWIKVSRALP EKQGEIEAQIKDLGQLEKKLEDLEEQLNHLLLffLSPIRNQLEIYNQPNQEGPFDVQETEIAVQAKQPDVEEILSKGQ HLYKEKPATQPVKRKLEDLSSEWKAVNRLLQELRAKQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSS LMLEVPALADFNRAWTELTDWLSLLDQVIKSQRVMVGDLEDINEMIIKQKATMQDLEQRRPQLEELITAAQNLKNKT SNQEARTIITDRIERIQNQWDEVQEHLQNRRQQLNEMLKDSTQWLEAKEEAEQVLGQARAKLESffKEGPYTVDAIQK KITETKQLAKDLRQWQTNVDVANDLALKLLRDYSADDTRKVHMITENINASWRSIHKRVSEREAALEETHRLLQQFP LDLEKFLAWLTEAETTANVLQDATRKERLLEDSKGVKELMKQWQDLQGEIEAHTDVYHNLDENSQKILRSLEGSDDA VLLQRRLDNMNFKWSELRKKSLNIRSHLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPAVQKQNDVHR AFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNVTRLLRKQAEEVNTEWEKLNLHSADWQ RKIDETLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLT TLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQT TCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTI YDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRL· GLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQA KCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAK HPRMGYLPVQTVLE⑶NMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESI DDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSP PEMMPTSPQSPRDAELIAEAKLLRQHKGRLEARMQILEDHNKQLESQLHRLRQLLEQPQAEAKVNGTTVSSPSTSLQ RSDSSQPMLLRVVGSQTSDSMGEEDLLSPPQDTSTGLEEVMEQLNNSFPSSRGRNTPGKPMREDTM
[0135] SEQ ID NO 2(外显子43):
[0136] AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAGGUCGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGC CUGUGG
[0137] SEQ ID NO 3(外显子46):
[0138] UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC
[0139] SEQ ID NO 4(外显子50):
[0140] GGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGG
[0141] SEQ ID NO 5(外显子51):
[0142] CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUC
[0143] UCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUAC
[0144] SEQ ID NO 6(外显子52):
[0145] AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAG CAAUCAAGAGGCU
[0146] SEQ ID NO 7(外显子53):
[0147] AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAG
[0148] 表1:用于跳跃DMD基因外显子43的寡核苷酸
[0150]
[0151] 表2:用于跳跃DMD基因外显子46的寡核苷酸
[0154]
[0155] 表3:用于跳跃DMD基因外显子50的寡核苷酸
[0162]
[0163] 表5:用于跳跃DMD基因外显子52的寡核苷酸
[0166]
[0167] 表6:用于跳跃DMD基因外显子53的寡核苷酸
[0169]
[0170] 表7:用于跳跃示出的DMD基因其他外显子的寡核苷酸
[0177]
【附图说明】
[0178] 图1.在人对照肌管中，在500nM检验靶向外显子43的一系列A0N(PS237、PS238和 PS240;分别为SEQ ID NO eSdeuehPSSSTUEQ ID N0 65)可重复地诱导外显子43跳跃的 最高水平(M: DNA大小标志物;NT:未处理的细胞）。
[0179] 图2.在来自外显子45缺失的DMD患者的肌管中，在两种不同浓度(50和150nM)检验 靶向外显子46的一系列A0N(PS177、PS179、PS181 和PS182;分别为SEQ ID N0 91、70、110和 lHhPSlSSUEQ ID N0 117)可重复地诱导外显子46跳跃的最高水平(M:DNA大小标志物）。
[0180] 图3.在人对照肌管中，在500nM检验靶向外显子50的一系列A0N(PS245、PS246、 PS247和PS248;分别为SEQ ID NO 167、165、166和WThPSSASUEQ ID NO 127)可重复地诱 导外显子50跳跃的最高水平(M:DNA大小标志物;NT:未处理的细胞）。
[0181] 图4.在人对照肌管中，在两种不同浓度(200和500nM)检验靶向外显子52的两个新 的A0N(PS232和PS236;分别为SEQ ID N0 246和299)，并直接与以前描述的A0N(52-1)进行 比较。PS236(SEQ ID N0 299)可重复地诱导外显子52跳跃的最高水平(M:DNA大小标志物； NT:未处理的细胞）。
【主权项】
1. 分子，所述分子与选自以下核苷酸序列之一中的至少8个核苷酸的连续区段结合： 用于外显子50的跳跃的 5，-GGCG⑶AAACC⑶UUACUUCAAGAGCUGAGGGC AAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGG-3'（SEQ ID N0:4); 用于外显子43的跳跃的 5，AGAUA ⑶⑶ ACAACAAAG ⑶ CAG ⑶ CGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCA 觀^ CAACGCCUGUGG-3'（SEQ ID NO:2); 用于外显子46的跳跃的 S'UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGA AAAGC-3'（SEQ ID NO:3); 用于外显子51的跳跃的 5，CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAA AUGCCAUCUUCCUUGAUG UUGGAGGUAC-3'（SEQ ID NO:5); 用于外显子52的跳跃的 5，AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGC⑶CCCCA⑶UGGAAGAA⑶CAUUACCG⑶GCCCAAAAUUUGA^^ GACCAGCAAUCAAGAGGCU-3'（SEQ ID NO:6);以及 用于外显子53的跳跃的 5'AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAAA GCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGA G-3'（SEQ ID NO:7)。2. 如权利要求1所述的分子，其中所述分子包含选自表1-6中所示的SEQ ID NO:8-358 和/或SEQ ID NO 529-535的反义核苷酸序列或由选自表1-6中所示的SEQ ID NO:8-358和/ 或SEQ ID NO 529-535的反义核苷酸序列组成。3. 如权利要求2所述的分子，其中所述分子包含选自SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:65、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:117、SEQ ID N0:127、SEQ ID NO: 165、SEQ ID N0:166、SEQ ID N0:167、SEQ ID N0:246、SEQ ID N0:299和SEQ ID N0:357的 反义核苷酸序列或由选自SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:65、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:117、SEQ ID N0:127、SEQ ID N0:165、SEQ ID N0:166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:299和SEQ ID NO:357的反义核苷酸序列组成。4. 如权利要求1-2任一项所述的分子，其包含2 ' -0-烷基磷硫酰反义寡核苷酸。5. 如权利要求4所述的分子，其包含2 ' -0甲基磷硫酰核糖。6. 基于病毒的载体，其包含驱动权利要求1-5中任一项所定义的分子表达的表达盒。7. 用作药物的权利要求1-5中的任一项所述的分子或权利要求6所述的基于病毒的载 体，其优选用于调节DMD或BMD患者的DMD前mRNA的剪接或用于治疗DMD或BMD患者。8. 药物组合物，包含权利要求1-5中任一项所定义的分子和/或权利要求6所述的载体， 药物可接受的载体，并且任选地与能诱导或促进患者DMD前mRNA的外显子6、7、11、17、19、 21、43、44、45、50-53、55、57、59、62、63、65、66、69 或 75 中至少一个的跳跃的分子组合。9. 用于诱导和/或促进患者中，优选患者分离的细胞中DMD前mRNA的外显子43、外显子 46、外显子50-53中至少一个的跳跃的方法，所述方法包括向所述细胞和/或所述患者提供 权利要求1-5中任一项所述的分子或权利要求6所述的载体。10. 如权利要求9所述的方法，其中使用能诱导或促进患者DMD前mRNA的外显子6、7、11、 17、19、21、43、44、45、50-53、55、57、59、62、63、65、66、69 或 75 中至少一个的跳跃的其他分 子。11. 权利要求1-5中任一项所述的分子、权利要求6所述的载体或权利要求8所述的药物 组合物在调节DMD前mRNA的剪接中的用途或制备用于治疗DMD或BMD患者的药物中的用途。
【专利摘要】本发明涉及方法，其中使用分子诱导和/或促进患者中，优选患者分离的细胞中DMD前mRNA的外显子43、外显子46、外显子50-53中至少一个的跳跃，所述方法包括向所述细胞和/或所述患者提供分子。本发明还涉及所述分子本身。
【IPC分类】C12N15/86, A61P21/00, A61K31/7088, C12N15/113
【公开号】CN105647921
【申请号】
【发明人】约瑟夫斯·约翰尼斯·德吉姆彼, 勒德乌斯·约翰尼斯·普拉滕伯格, 朱迪思·克里斯蒂娜·塞奥多拉·万多伊特科姆, 安妮姆耶克·阿斯马-鲁斯, 盖瑞特-扬·保德维金·万欧门
【申请人】莱顿教学医院, 普罗森那技术公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2009年3月11日