有效跳跃人杜兴肌营养不良基因外显子43、46、50-53中至少一个的方法和手段的利记博彩app
【专利说明】有效跳跃人杜兴肌营养不良基因外显子43、46、50-53中至少 一^的方法和手段 发明领域
[0001] 本发明涉及遗传学领域，更具体而言涉及人类遗传学领域。本发明尤其涉及人杜 兴肌营养不良前mRNA剪接的调节。
[0002] 发明背景
[0003] 肌病是导致肌肉功能性损伤的病症。肌营养不良(MD)是指特征为骨骼肌的逐渐衰 弱和退化的遗传学疾病。杜兴肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD)和贝克肌 营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD)是最常见的儿童形式的肌营养不良。它们是 隐性遗传疾病，因为负责DMD和BMD的基因位于X染色体上，突变主要影响男性，发病率为每 3500名男孩中约1例。
[0004] DMD和BMD是由编码抗肌萎缩蛋白的DMD基因的遗传学缺陷导致，所述抗肌萎缩蛋 白是细胞骨架和细胞外基质之间相互作用所必需的肌肉蛋白，用于在收缩期间维持肌纤维 的稳定性。DMD是严重且致死的神经肌肉病症，导致在12岁之前依靠轮椅维持，并且由于呼 吸或心脏衰竭，DMD患者通常在30岁之前死去。相比之下，BMD患者通常直至晚年仍能走动， 并具有近乎正常的预期寿命。DMD基因中的DMD突变特征为移码插入或缺失或无义点突变， 导致功能性抗肌萎缩蛋白的缺乏。通常，BMD突变保持阅读框完整，允许合成具有部分功能 性抗肌萎缩蛋白。
[0005] 最近十年，已经出现为了恢复抗肌萎缩蛋白转录本的破坏的阅读框而进行的剪接 的特定修饰，作为杜兴肌营养不良（DMD)的有希望的疗法（van 0mmen，van Deutekom, Aartsma-Rus,Curr Opin Mol Ther.2008；10(2):140-9,Yokota,Duddy,Partidge,Acta Myol.2007；26(3):179-84,van Deutekom et al.,N Engl J Med.2007；357(26):2677-86)〇
[0006] 使用干扰剪接信号的反义寡核苷酸(AON)，可以在DMD前mRNA中诱导特定的外显子 跳跃，从而恢复开放阅读框并将严重的DMD转变成较轻微的BMD表型（van Deutekom et al.Hum Mol Genet.2001；10:1547-54；Aartsma-Rus et al.,Hum Mol Genet 2003；12(8): 907-14.)。在由于外显子23中无义突变导致抗肌萎缩蛋白缺乏的mdx小鼠模型中首次获得 体内概念验证(口1'〇<^-〇卜(：〇1^口1:)。肌内注射和静脉内注射革巴向突变的外显子23的401'1恢 复抗肌萎缩蛋白的表达持续至少三个月（Lu et al.Nat Med.2003;8:1009_14;Lu et al·, Proc Natl Acad Sci U S A.2005; 102(1): 198-203)。这是通过纤维膜处抗肌萎缩蛋白关 联蛋白的恢复以及处理的肌肉的功能性改善来实现的。还在hDMD小鼠模型中实现人外显子 的体内跳跃，所述hDMD小鼠模型包含整合在小鼠染色体5中的人DMD基因的完整拷贝 (Bremmer-Bout et al.Molecular Therapy.2004;10:232-40;'t Hoen et al.J Biol Chem.2008；283:5899-907)〇
[0007] 最近，成功完成了首次用于人体的研究，其中将诱导外显子51跳跃的AON注入4名 DMD患者胫骨前肌的小区域内。在治疗的所有四名患者的大多数肌纤维中观察到新抗肌萎 缩蛋白表达，并且该Α0Ν是安全且耐受良好的（van Deutekom et al.N Engl J Med.2007; 357:2677-86)。
[0008] 发明的详细描述
[0009]
[0010] 第一方面，本发明提供了诱导和/或促进患者中，优选在患者分离的细胞中，DMD前 mRNA的外显子43、46、50-53中至少一个的跳跃的方法，所述方法包括向所述细胞和/或所述 患者提供与所述外显子中的至少8个核苷酸的连续区段结合的分子。应当理解，所述方法包 括体外、体内或离体方法。
[0011]因此，提供了诱导和/或促进患者中，优选在所述患者分离的细胞中，DMD前mRNA的 外显子43、46、50-53中至少一个的跳跃的方法，所述方法包括向所述细胞和/或所述患者提 供与所述外显子中的至少8个核苷酸的连续区段结合的分子。
[0012] 如本文所定义，DMD前mRNA优选表示DMD或BMD患者DMD基因的前mRNA。
[0013]优选地，患者意图表示患有本文随后所定义的具有DMD或BMD的患者，或由于他或 她的遗传学背景而易于发展为DMD或BMD的患者。就DMD患者而言，所用的寡核苷酸优选纠正 所述患者DMD基因所呈现的一个突变，并且因此优选会产生看起来与BMD蛋白类似的DMD蛋 白：所述蛋白优选是如本文随后所定义的功能性抗肌萎缩蛋白。就BMD患者而言，所用的寡 核苷酸优选纠正所述患者BMD基因所呈现的一个突变，并且因此优选会产生抗肌萎缩蛋白， 其比原来存在于所述BMD患者中的抗肌萎缩蛋白功能性更强。
[0014]外显子跳跃是指诱导细胞中的成熟mRNA不包含正常存在其中的特定外显子。通过 向表达所述mRNA的前mRNA的细胞提供能干扰关键序列的分子能干扰外显子包含信号的分 子来进行外显子跳跃，所述关键序列例如所述外显子剪接所必需的剪接受体序列的剪接供 体，所述外显子包含信号是识别一段核苷酸作为待包括在mRNA中的外显子所必需的。术语 前mRNA是指通过转录从细胞核中的DNA模板合成的未加工的或部分加工的前体mRNA。
[0015] 在本发明的语境中，本文所指的诱导和/或促进外显子跳跃表示治疗的患者的一 个或多个(肌肉）细胞中至少1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更 多的DMD mRNA不包含所述外显子。如实施例中所述，这优选通过PCR来评价。
[0016] 优选地，本发明方法通过诱导和/或促进患者的一个或多个(肌肉）细胞中的DMD前 mRNA的外显子43、46、50-53中至少一个的跳跃，向所述患者提供功能性抗肌萎缩蛋白和/或 减少所述患者中异常抗肌萎缩蛋白的产生和/或增加所述患者中功能性抗肌萎缩蛋白的产 生。向患者提供功能性抗肌萎缩蛋白和/或减少所述患者中异常抗肌萎缩蛋白的产生通常 应用于DMD患者中。增加所述患者中功能性抗肌萎缩蛋白的产生通常应用于BMD患者。
[0017] 因此，优选的方法是这样的方法:其中向患者或所述患者的一个或多个细胞提供 功能性抗肌萎缩蛋白和/或其中减少所述患者中异常抗肌萎缩蛋白的产生和/或其中增加 所述患者中功能性抗肌萎缩蛋白的产生，其中所述异常或功能性抗肌萎缩蛋白的水平是通 过与开始方法时所述患者中的所述抗肌萎缩蛋白的水平比较来评价。
[0018] 减少异常抗肌萎缩蛋白的产生可以在mRNA水平上评价，并且优选表示通过RT PCR 仍然可检测到异常抗肌萎缩蛋白mRNA最初数量的99%、90 %、80 %、70 %、60 %、50 %、40 %、 30 %、20 %、10 %、5 %或更少。异常抗肌萎缩蛋白mRNA或蛋白在本文也被称为非功能性抗肌 萎缩蛋白mRNA或蛋白。非功能性抗肌萎缩蛋白优选的是不能与肌动蛋白和/或DGC蛋白复合 物成员结合的抗肌萎缩蛋白。非功能性抗肌萎缩蛋白或抗肌萎缩蛋白mRNA通常没有或不编 码具有蛋白的完整C-末端的抗肌萎缩蛋白。
[0019] 增加所述患者或所述患者细胞中功能性抗肌萎缩蛋白的产生可以在mRNA水平上 评价(通过RT-PCR分析），并且优选表示通过RT PCR可以检测到可检测数量的功能性抗肌萎 缩蛋白mRNA。在另一个实施方案中，可检测到的抗肌萎缩蛋白mRNA的1 %、5%、10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多是功能性抗肌萎缩蛋白mRNA。增加所述患者 或所述患者细胞中功能性抗肌萎缩蛋白的产生可以在蛋白水平上评价(通过免疫荧光和 western印迹分析），并且优选表示通过免疫焚光或western印迹分析可以检测到可检测数 量的功能性抗肌萎缩蛋白。在另一个实施方案中，可检测到的抗肌萎缩蛋白的1 %、5%、 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多是功能性抗肌萎缩蛋白。
[0020] 如本文所定义，功能性抗肌萎缩蛋白优选是与具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序 列的蛋白相应的野生型抗肌萎缩蛋白。功能性抗肌萎缩蛋白优选是这样的抗肌萎缩蛋白， 其具有在它的N末端部分中的肌动蛋白结合结构域(N末端的前240个氨基酸）、半胱氨酸富 集结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(C末端的最后325个氨基酸），如本领域技术 人员所已知的，这些结构域的每一个都存在于野生型抗肌萎缩蛋白中。本文所指的氨基酸 与SEQ ID N0:1表示的野生型抗肌萎缩蛋白的氨基酸相符合。换而言之，功能性抗肌萎缩蛋 白是至少在一定程度上表现出野生型抗肌萎缩蛋白活性的抗肌萎缩蛋白。"至少在一定程 度上"优选表示野生型功能性抗肌萎缩蛋白的相应活性的至少10%、20%、30%、40%、 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或100 %。在本文中，功能性抗肌萎缩蛋白的活性是优选 与肌动蛋白和与抗肌萎缩蛋白关联的糖蛋白复合物（DGC)结合(Aartsma-Rus A et al, (2006)，莱顿杜兴肌营养不良突变数据库条目：确定阅读框规则的突变类型反常情况的综 述，Muscle Nerve ,34:135-144)。通过使用总蛋白提取物的免疫共沉淀或来自肌肉活检的 横断面的免疫荧光分析可以显现抗肌萎缩蛋白与肌动蛋白和与DGC复合物的结合，这对本 领技术人员是已知的。
[0021] 患杜兴肌营养不良的个体或患者通常在编码抗肌萎缩蛋白的基因中具有突变，其 阻止完整蛋白的合成，即提前的终止阻止C-末端的合成。在贝克肌营养不良中，DMD基因与 野生型基因比较也包含突变，但是所述突变通常不会诱导提前的终止且通常合成C-末端。 因此合成的功能性抗肌萎缩蛋白具有至少与野生型蛋白一样的活性，尽管没有必要是相同 的活性量。BMD个体的基因组通常编码这样的抗肌萎缩蛋白，其包含N末端部分(N末端的前 240个氨基酸）、半胱氨酸富集结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(C末端的最后325 个氨基酸），但是它的中央杆状结构域可以短于野生型抗肌萎缩蛋白之一 (Aartsma-Rus A et al，（2006)，莱顿杜兴肌营养不良突变数据库条目：确定阅读框规则的突变类型和反常 情况的综述，Muscle NerVe，34:135-144)。用于DMD治疗的外显子跳跃通常通过跳跃杆状结 构域中的外显子以纠正阅读框和允许包含C-末端的抗肌萎缩蛋白的残余部分的合成，克服 前mRNA中的提前终止，尽管由于较小的杆状结构域，所述蛋白略小。在优选的实施方案中， 患有DMD并通过本文所定义的方法治疗的个体会提供至少在一定程度上表现出野生型抗肌 萎缩蛋白活性的抗肌萎缩蛋白。更优选地，如果所述个体是杜兴患者或疑似杜兴患者，功能 性抗肌萎缩蛋白是患有BMD个体的抗肌萎缩蛋白：通常所述抗肌萎缩蛋白能与肌动蛋白和 DGC两者相互作用，但是它的中央杆状结构域可以短于野生型抗肌萎缩蛋白的中央杆状结 构域(Aartsma-Rus A et al, (2006)，莱顿杜兴肌营养不良突变数据库条目：确定阅读框规 则的突变类型和反常情况的综述，Muscle Nerve ,34:135-144)。野生型抗肌萎缩蛋白的中 央杆状结构域包含24个血影蛋白样重复(Aartsma-Rus A et &1，（2006)，莱顿杜兴肌营养 不良突变数据库条目：确定阅读框规则的突变类型和反常情况的综述，Muscle NerVe，34: 135-144)。例如，本文所提供的抗肌萎缩蛋白的中央杆状结构域可以包含5-23个、10-22个 或12-18个血影蛋白样重复，只要它能与肌动蛋白和与DGC结合。
[0022] 本发明方法可以缓解患者生肌细胞或肌细胞的一个或多个特征或缓解具有下述 缺失的DMD患者的一种或多种症状:所述缺失包括但不限于DMD基因中的外显子44、44-46、 44-47、44-48、44-49、44-51、44-53(可通过外显子43跳跃纠正）、19-45、21-45、43-45、45、 47-54、47-56(可通过外显子46跳跃纠正）、51、51-53、51-55、51-57(可通过外显子50跳跃纠 正）、13-50、19-50、29-50、43-50、45-50、47-50、48-50、49-50、50、52(可通过外显子 51 跳跃 纠正）、外显子8-51、51、53、53-55、53-57、53-59、53-60(可通过外显子52跳跃纠正）和外显 子 10-52、42-52、43-52、45-52、47-52、48-52、49-52、50-52、52(可通过外显子53跳跃纠正）， 这共占所有具有缺失的DMD患者的68%(Aartsma-Rus et al.，Hum.Mut