AGGUAC-3'（SEQ ID N0:5) 用于外显子51的跳跃；
[0048] 5 ' - AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAA CUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU-3'（SEQ ID N0:6)用于外显子 52的跳跃；以及
[0049] S'-AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGG AAGAA GCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAG-3'（SEQ ID N0:7)用于外显子53的跳跃.
[0050] 在理论上可以制备的与所述外显子之一中通过SEQ ID NO 2-7所定义的连续核苷 酸区段结合的多种分子之中，本发明提供了可以在本方法中使用的用于有效跳跃外显子 43、外显子46和/或外显子50-53中至少一个的不同的分子。尽管跳跃效应可以针对所述区 段中相对高密度的推定的SR蛋白结合位点，但是可能有其他参数参与促成所述分子或其他 分子的摄取，细胞内参数例如杂交双链的热动力、动力或结构特征。
[0051 ] 发现与包括在SEQ ID N0 2-7中任一个的连续区段或组成SEQ ID N0 2-7中任一 个的连续区段结合的分子分别导致被提供该分子的细胞和/或患者中外显子43、外显子46 和/或外显子50-53的高效跳跃。因此，在优选的实施方案中，提供了这样的方法:其中分子 与SEQ ID N0 2-7中至少8、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸的连续区段结 合。
[0052] 在用于诱导和/或促进跳跃外显子43、外显子46和/或外显子50-53中任一个的优 选实施方案中，本发明提供的分子包含反义核苷酸序列或由其组成，所述反义核苷酸序列 选自表1-6中任一个所述的反义核苷酸序列。本发明分子优选包含SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 246、SEQ ID NO 299、SEQ ID NO: 357的反义核苷酸序列或由 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 91、 SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 246、SEQ ID NO 299、SEQ ID NO :357的反义核苷酸序列组成。
[0053] 本发明的优选分子包含8-50个核苷酸或碱基的核苷酸类或核苷酸或反义寡核苷 酸序列，更优选10-50个核苷酸，更优选20-40个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，例如20个核 苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸、25个核苷酸、26个核苷酸、27个核 苷酸、28个核苷酸、29个核苷酸、30个核苷酸、31个核苷酸、32个核苷酸、33个核苷酸、34个核 苷酸、35个核苷酸、36个核苷酸、37个核苷酸、38个核苷酸、39个核苷酸、40个核苷酸、41个核 苷酸、42个核苷酸、43个核苷酸、44个核苷酸、45个核苷酸、46个核苷酸、47个核苷酸、48个核 苷酸、49个核苷酸或50个核苷酸。本发明的最优选分子包含25个核苷酸的核苷酸类序列。
[0054] 此外，所示的序列没有一个源自剪接点的保守部分。因此，所述分子不可能介导来 自DMD前mRNA的其他外显子或来自其他基因的外显子的差异剪接。
[0055] 在一个实施方案中，本发明的分子是与确定序列结合的化合物分子，或者是已经 被修饰得能与DMD前RNA分子上的对应核苷酸序列结合的诸如RNA结合蛋白或非天然的锌指 蛋白的蛋白。用于筛查与特定核苷酸序列结合的化合物分子的方法例如在PCT/NL01/00697 和美国专利第6，875，736号中公开，通过引用将二者并入本文。用于设计与特定核苷酸序列 结合的RNA结合锌指蛋白的方法在Friesen and Darby,Nature Structural Biology 5: 543-546(1998)中公开，通过引用将其并入本文。
[0056] 本发明的优选分子与SEQ ID NO 2:5'-AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAGGUCGGAUUGACAU UAUUCA UAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGCCUGUGG-3 ' 序列的至少一部分结合，所述 序列存在于DMD基因的外显子43中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 8-SEQ ID NO 69的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 8-SEQ ID NO 69的反义核苷酸序列组成。
[0057] 在更优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 16和/或SEQ ID NO 65的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 16和/或SEQ ID N065的反义核苷酸序列组成。
[0058]在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQ ID N0 65的反义核苷酸序列 或由SEQ ID N0 65的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD前 mRNA外显子43的剪接中是非常有效的。
[0059]本发明的另一个优选分子与SEQ ID NO 3:5'-UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCU AGUAUCCCACUU G AACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC-3 ' 序列的至少一部分结合，所述 序列存在于DMD基因的外显子46中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 70-SEQ ID NO 122的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 70-SEQ ID NO 122的反义核苷酸序列组成。 在更优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 110和/或SEQ ID N0117的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 110和/或SEQ ID N0117的反义核苷酸序列组成。
[0060]在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 117的反义核苷酸序 列或由SEQ ID N0 117的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD 前mRNA外显子46的剪接中是非常有效的。
[0061 ]本发明的另一个优选分子与SEQ ID NO 4:5'-GGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAG GGCAAAGCAGCC UGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGG-3 ' 序列的至少一部分结合，所述序列存 在于DMD基因的外显子50中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 123-SEQ ID N0 167和/或SEQ ID NO 529-SEQ ID NO 535的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 123-SEQ ID NO 167和/或SEQ ID NO 529-SEQ ID NO 535的反义核苷酸序列组成
[0062] 在更优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 127、或SEQ ID NO 165、或SEQ ID NO 166和/或SEQ ID NO 167的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 127、或SEQ ID NO 165、或SEQ ID NO 166和/或SEQ ID NO 167的反义核苷酸序列组成。
[0063] 在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 127的反义核苷酸序 列或由SEQ ID N0 127的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD 前mRNA外显子50的剪接中是非常有效的。
[0064] 本发明的另一个优选分子与SEQ ID NO 5:5，-CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACAC AACCUGUGGUUAC UAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUG UUGGAGGUAC-3 ' 序 列的至少一部分结合，所述序列存在于DMD基因的外显子51中。更优选地，本发明提供的分 子包含SEQ ID NO 168-SEQ ID N0 241的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 168-SEQ ID N0 241的反义核苷酸序列组成。
[0065] 本发明的另一个优选分子与SEQ ID NO 6:5'-AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAG UUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU-3 ' 序列的至少一部 分结合，所述序列存在于DMD基因的外显子52中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 242-SEQ ID NO 310的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 242-SEQ ID NO 310的反义核苷 酸序列组成。在更优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 246和/或SEQ ID NO 299的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 246和/或SEQ ID NO 299的反义核苷酸序列组 成。在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 299的反义核苷酸序列或由 SEQ ID N0 299的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD前mRNA 外显子52的剪接中是非常有效的。
[0066] 本发明的另一个优选分子与SEQ ID NO 7:5'-AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGG AAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAG⑶CUUAGGACAGGCCAGAG-3 '序列的至少一部分结合，所述序列存 在于DMD基因的外显子53中。更优选地，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 311-SEQ ID N0 358的反义核苷酸序列或由SEQ ID NO 311-SEQ ID NO 358的反义核苷酸序列组成。
[0067] 在最优选的实施方案中，本发明提供的分子包含SEQ ID NO 357的反义核苷酸序 列或由SEQ ID N0 357的反义核苷酸序列组成。发现该分子在调节肌细胞和/或患者的DMD 前mRNA外显子53的剪接中是非常有效的。
[0068]本发明分子的核苷酸序列可以包含RNA残基、一个或多个DNA残基和/或一个或多 个核苷酸类似物或等同物，这将在下文进一步详述。
[0069]优选地，本发明分子包含一个或多个被修饰的残基，以增加核酸酶抗性和/或增加 反义核苷酸与靶序列的亲和力。因此，在优选的实施方案中，所述反义核苷酸序列包含至少 一个核苷酸类似物或等同物，其中将核苷酸类似物或等同物定义为具有修饰碱基和/或具 有修饰主链和/或具有非天然核苷间连接或这些修饰的组合的残基。
[0070] 在优选的实施方案中，所述核苷酸类似物或等同物包含修饰的主链。这类主链的 实例通过下述修饰提供：吗啉代主链、氨基甲酸酯主链、硅氧烷主链、硫化、亚砜和砜主链、 甲酰乙酰基（f 0 r m a c e t y 1 )和硫代甲酰乙酰基主链、亚甲基甲酰乙酰基 (methyleneformacetyl)主链、乙酰核糖主链、含有稀经的主链、氨基磺酸、磺酸和磺胺主 链、亚甲基亚胺和亚甲基肼主链，以及氨基主链。磷酰二胺吗啉代寡聚物是之前已被证实为 反义试剂的修饰的主链寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有不带电的主链，其中DNA的脱氧核糖 由六元环取代，且磷酸二酯连接由磷酰二胺连接取代。吗啉代寡核苷酸对酶降解是抗性的， 并且似乎是通过阻止翻译或干扰前mRNA剪接而非通过激活RNase Η而发挥反义试剂的功 能。通过物理破坏细胞膜的方法已成功地将吗啉代寡核苷酸递送至组织培养细胞中，并且 一项比较数种这些方法的研究发现划痕标记是最有效的递送方法;然而，由于吗啉代主链 不带电，阳离子脂质不是吗啉代寡核苷酸摄入细胞中的有效介导物。一项最近的报道表明 吗啉代寡核苷酸形成三螺旋，并且由于非离子型主链，这些研究表明在不存在镁的条件下， 吗啉代寡核苷酸能形成三螺旋。
[0071] 优选地，主链残基之间的连接不包含磷原子，例如通过短链烷基或环烷基核苷间 连接形成的连接、混合的杂原子和烷基或环烷基的核苷间连接或一个或多个短链杂原子或 杂环的核苷间连接。
[0072]优选的核苷酸类似物或等同物包括具有修饰的聚酰胺主链的肽核酸（ΡΝΑ) (Nielsen，et al. (1991 )Science 254,1497-1500)。基于ΡΝΑ的分子就碱基对识别而言是真 正的DNA分子模拟物。PNA的主链由通过肽键连接的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元组成，其中核 苷碱基通过亚甲羰键与主链连接。可选的主链包含一碳延伸的吡咯烷PNA单体 (Govindaraju and Kumar(2005)Chem. Commun ,495-497)。由于PN