[0106] 在本方面中，包含特定核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸的系统性递送可能 导致靶向肌细胞的子集，而包含不同核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸可能导致靶向 肌细胞的不同子集。因此，在本实施方案中，优选使用包含不同核苷酸类似物或等同物的寡 核苷酸组合来调节至少一类肌细胞中的DMD mRNA的剪接。
[0107] 在优选的实施方案中，提供了用作药物的分子或基于病毒的载体，优选用于调节 DMD前mRNA的剪接，更优选用于促进或诱导本文所示的外显子43、46、50-53中任一个的跳 跃。
[0108] 腦
[0109] 1=方面，本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或分子和/或表达本发明一段或 多段反义序列的基于病毒的载体和/或药物组合物在调节DMD前mRNA剪接中的用途。优选在 体外人生肌细胞或肌细胞中调节所述剪接。更优选的是在体内人肌细胞中调节剪接。因此， 本发明还涉及本文所定义的分子和/或本文所定义的载体和/或本文所定义的药物组合物 在调节DMD前mRNA剪接中的作用或在制备用于治疗DMD或BMD患者的药物中的用途。
[0110] 在本文及其权利要求书中，动词"包含"与它的同源词用的是它的非限制性意义， 表示包括紧接着该词的项目但并不排除未具体提到的项目。此外，动词"由…组成"可以用 "基本上由…组成"取代，表示本文所定义的分子或基于病毒的载体或组合物可以包括具体 指出的组分之外的其他组分，所述其他组分不会改变本发明的特有特征。此外，由不定冠词 "一个(a)"或"一个(an)"提及的元件不排除存在多于一个所述元件的可能性，除非文中明 确指出有且只有一个所述元件。因此，不定冠词"一个(a)"或"一个(an)"通常表示"至少一 个"。
[0111] 可以将本文所示的每个实施方案组合起来，除非另有所指。通过引用将本说明书 所引用的所有专利和参考文献整体并入本文。
[0112] 下面提供的实施例仅为说明性目的，并非意图以任何方式限制本发明的范围。 实施例
[0113] 实施例1-4
[0114] 材料和方法
[0115] (部分地)基于通过m-fold程序所预测的靶外显子RNA的重叠开放的二级结构，（部 分地)基于通过ESE-finder软件所预测的重叠潜在的SR-蛋白结合位点来设计AON。AON由 Prosensa Therapeutics B· V· (Leiden，Netherlands)合成，且包含2甲基RNA和全长磷 硫酰(PS)主链。
[0116] 组织培养、转染和RT-PCR分析
[0117] 如前述处理来自健康个体（"人对照"实施例1、3和4;外显子43、50、52跳跃)或携 带外显子45缺失的DMD患者(实施例2;外显子46跳跃）的肌管培养物(Aartsma-Rus et al.， Neuromuscul.Disord.2002;12:S71-77以及Hum Mol Genet 2003;12(8):907-14)。为了筛 查AON，用50nM和150nM(实施例2)、200nM和500nM(实施例4)或只有500nM(实施例1和3)的每 种AON转染肌管培养物。使用转染试剂UNIFectylin(Prosensa Therapeutics BV, 如1：]161'1&11(18)，每口8八01'1加2口11]1'1正6(^71;[11。通过用革[11向外显子（43、46、50、51、52或53) 侧翼外显子中引物的巢式RT-PCR分析来确定外显子跳跃效率。从琼脂糖凝胶分离PCR片段 用于序列确认。为了定量，使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，USA)上 的DNA 1000LabChips Kit分析PCR产物。
[0118] 结果
[0119] DMD外显子43跳跃。
[0120] 设计靶向外显子43序列的一系列Α0Ν，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对 分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQ ID N0 2的外显子43中连续核苷 酸区段的几乎所有的Α0Ν都确实能诱导外显子43跳跃。如图1所示，PS237(SEQ ID N0:65)在 500nM时可重复地诱导外显子43跳跃的最高水平（高达66%)。为了比较，还显示了 PS238和 PS240,诱导外显子43跳跃的水平分别高达13%和36% (图1)。通过对新的更小的转录本片 段的序列分析来确认外显子43的精确跳跃。在未处理的细胞(NT)中没有观察到外显子43跳 跃。
[0121] DMD外显子46跳跃。
[0122] 设计靶向外显子46序列的一系列Α0Ν，并转染进来自DMD基因中携带外显子45缺失 的DMD患者的肌管培养物中。对于携带这类突变的患者，反义诱导的外显子46跳跃将诱导确 实可以缓解所述疾病的一种或多种症状的新的BMD-样抗肌萎缩蛋白的合成。随后对分离的 RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQ ID N0 3的外显子46中连续核苷酸区段 的几乎所有的Α0Ν都确实能诱导外显子46跳跃，甚至在50nM的相对低的Α0Ν浓度时。如图2所 示，PS182(SEQ ID ^):117)可重复地诱导外显子46跳跃的最高水平(在5〇11]\1时高达50%且 在150nM时高达74%)。为了比较，还显示了 PS177、PS179和PS181，在150nM时诱导外显子46 跳跃的水平分别高达55%、58%和42% (图2)。通过对新的更小的转录本片段的序列分析来 确认外显子46的精确跳跃。在未处理的细胞(NT)中没有观察到外显子46跳跃。
[0123] DMD外显子50跳跃。
[0124] 设计靶向外显子50序列的一系列Α0Ν，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对 分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQ ID N0 4的外显子50中连续核苷 酸区段的几乎所有的Α0Ν都确实能诱导外显子50跳跃。如图3所示，PS248(SEQ ID N0:127) 可重复地诱导外显子50跳跃的最高水平(在500nM时高达35%)。为了比较，还显示了 PS245、 PS246和PS247,在500nM时诱导外显子50跳跃水平高达14-16% (图3)。通过对新的更小的转 录本片段的序列分析来确认外显子50的精确跳跃。在未处理的细胞(NT)中没有观察到外显 子50跳跃。
[0125] DMD外显子51跳跃。
[0126] 设计靶向外显子51序列的一系列Α0Ν，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对 分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQ ID N0 5的外显子51中连续核苷 酸区段的几乎所有的AON都确实能诱导外显子51跳跃。SEQ ID N0 180的AON可重复地诱导 外显子51跳跃的最高水平(未示出）。
[0127] DMD外显子52跳跃。
[0128] 设计靶向外显子52序列的一系列Α0Ν，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对 分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQ ID N0 6的外显子52中连续核苷 酸区段的几乎所有的Α0Ν都确实能诱导外显子52跳跃。如图4所示，PS236(SEQ ID N0: 299) 可重复地诱导外显子52跳跃的最高水平(在200nM时高达88%且在500nM时高达91 %)。为了 比较，还显示了 PS232和A0N52-K之前由Aartsma-Rus et al.公开，寡核苷酸2005)，当以 500nM施用时，诱导外显子52跳跃水平分别高达59 %和10 % (图4)。通过对新的更小的转录 本片段的序列分析来确认外显子52的精确跳跃。在未处理的细胞(NT)中没有观察到外显子 52跳跃。
[0129] DMD外显子53跳跃。
[0130]设计靶向外显子53序列的一系列Α0Ν，并转染进健康的对照肌管培养物中。随后对 分离的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定义为SEQ ID N0 7的外显子53中连续核苷 酸区段的几乎所有的Α0Ν都确实能诱导外显子53跳跃。SEQ ID N0 328的Α0Ν可重复地诱导 外显子53跳跃的最高水平(未示出）。
[0131] 序列表:
[0132] DMD基因氨基酸序列
[0133] SEQ ID NO 1:
[0134] MLffffEEVEDCYEREDVQKKTFTKffVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNV NKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSffVRQSTRNYPQV NVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMY ITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVT TSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGY MMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELND WLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESS⑶HATAALEEQLKVLGDR WANICRWTEDRffVLLQDILLKffQRLTEEQCLFSAffLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQS MGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQAVTTTQPSLTQTTVMETVTTVTTREQ ILVKHAQEELPPPPPQKKRQITVDSEIRKRLDVDITELHSWITRSEAVLQSPEFAIFRKEGNFSDLKEKVNAIEREK AEKFRKLQDASRSAQALVEQMVNEGVNADSIKQASEQLNSRWIEFCQLLSERLNWLEYQNNIIAFYNQLQQLEQMTT TAENWLKIQPTTPSEPTAIKSQLKICKDEVNRLSGLQPQIERLKIQSIALKEKGQGPMFLDADFVAFTNHFKQVFSD VQAREKELQTIFDTLPPMRYQETMSAIRTWVQQSETKLSIPQLSVTDYEIMEQRLGELQALQSSLQEQQSGLYYLST TVKEMSKKAPSEISRKYQSEFEEIEGRWKKLSSQLVEHCQKLEEQMNKLRKIQNHIQTLKKWMAEVDVFLKEEWPAL GDSEILKKQLKQCRLLVSDIQTIQPSLNSVNEGGQKIKNEAEPEFASRLETELKELNTQWDHMCQQVYARKEALKGG LEKTVSLQKDLSEMHEWMTQAEEEYLERDFEYKTPDELQKAVEEMKRAKEEAQQKEAKVKLLTESVNSVIAQAPPVA QEALKKELETLTTNYQWLCTRLNGKCKTLEEVWACWHELLSYLEKANKffLNEVEFKLKTTENIPGGAEEISEVLDSL ENLMRHSEDNPNQIRILAQTLTDGGVMDELINEELETFNSRWRELHEEAVRRQKLLEQSIQSAQETEKSLHLIQESL TFIDKQLAAYIADKVDAAQMPQEAQKIQSDLTSHEISLEEMKKHNQGKEAAQRVLSQIDVAQKKLQDVSMKFRLFQK PANFEQRLQESKMILDEVKMHLPALETKSVEQEVVQSQLNHCVNLYKSLSEVKSEVEMVIKTGRQIVQKKQTENPKE LDERVTALKLHYNELGAKVTERKQQLEKCLKLSRKMRKEMNVLTEWLAATDMELTKRSAVEGMPSNLDSEVAWGKAT QKEIEKQKVHLKSITEVGEALKTVLGKKETLVEDKLSLLNSNWIAVTSRAEEWLNLLLEYQKHMETFDQNVDHITKff IIQADTLLDESEKKKPQQKEDVLKRLKAELNDIRPKVDSTRDQAANLMANR⑶HCRKLVEPQISELNHRFAAISHRI KTGKASIPLKELEQFNSDIQKLLEPLEAEIQQGVNLKEEDFNKDMNEDNEGTVKELLQRGDNLQQRITDERKREEIK IKQQLLQTKHNALKDLRSQRRKKALEISHQWYQYKRQADDLLKCLDDIEKKLASLPEPRDERKIKEIDRELQKKKEE LNAVRRQAEGLSEDGAAMAVEPTQIQLSKRWREIESKFAQFRRLNFAQIHTVREETMMVMTEDMPLEISYVPSTYLT EITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALS