.2009)。
[0023] 可选择地，本发明方法可以改善患者肌细胞的一个或多个特征或缓解DMD患者的 一种或多种症状，所述DMD患者在DMD基因中具有小突变或具有外显子43、46、50-53的单一 外显子重复，这共占所有具有缺失的DMD患者的36 % (Aartsma-Rus et al，Hum. Mut. 2009)。
[0024] 此外，对于一些患者，除外显子43、外显子46和/或外显子50-53之外还需要一个其 他外显子的同时跳跃以恢复开放阅读框，包括具有特定缺失、小（点）突变或双重或多重外 显子重复的患者，例如(但不限于)外显子44-50的缺失需要外显子43和51的共跳跃、外显子 46-50的缺失需要外显子45和51的共跳跃、外显子44-52缺失需要外显子43和53的共跳跃、 外显子46-52的缺失需要外显子45和53的共跳跃、外显子51-54的缺失需要外显子50和55的 共跳跃、外显子53-54的缺失需要外显子52和55的共跳跃、外显子53-56的缺失需要外显子 52和57的共跳跃、外显子43或外显子44中的无义突变需要外显子43和44的共跳跃、外显子 45或外显子46中的无义突变需要外显子45和46的共跳跃、外显子50或外显子51中的无义突 变需要外显子50和51的共跳跃、外显子51或外显子52中的无义突变需要外显子51和52的共 跳跃、外显子52或外显子53中的无义突变需要外显子52和53的共跳跃、或双重或多重外显 子重复涉及外显子43、46、50、51、52和/或53。
[0025] 在优选的方法中，诱导外显子43的跳跃、或诱导外显子46的跳跃、或诱导外显子50 的跳跃、或诱导外显子51的跳跃、或诱导外显子52的跳跃、或诱导外显子53的跳跃。本发明 方法还包括诱导这些外显子中的两个的跳跃。例如，优选外显子50和51、或52和53、或43与 51、或43和53、或51和52的跳跃。根据患者中识别的突变的类型和身份（涉及的特定外显 子），本领域技术人员应当知道需要在所述患者中跳跃哪种外显子组合。
[0026] 在优选的方法中，缓解DMD或BMD患者的一种或多种症状和/或改善来自DMD或BMD 患者的一个或多个肌细胞的一个或多个特征。可以在细胞、组织水平或患者自身评价这类 症状或特征。
[0027] 可以通过对来自患者的生肌细胞或肌细胞进行下述任何测定来评价一个或多个 特征缓解:减少的肌细胞钙摄取、减少的胶原蛋白合成、改变的形态学、改变的脂质合成、减 少的氧化胁迫和/或改善的肌纤维功能、完整性和/或存活。通常使用肌肉活检的横断面的 免疫荧光和/或组织化学分析来评价这些参数。
[0028] 可以使用下述测定中的至少一个来评价肌纤维功能、完整性和/或存活的改善:血 液中肌酸激酶可检测地减少、疑似营养不良的肌肉的活检横断面中肌纤维坏死可检测地减 少和/或疑似营养不良的肌肉的活检横断面中肌纤维直径的同质性可检测地增加。这些测 定中的每一种都是本领域技术人员已知的。
[0029] 可以如Hodgetts et al (Hodgetts S ·，et al，（ 2006 )，Neuromuscular Disorders，16:591-602 · 2006)所述检测血液中的肌酸激酶。肌酸激酶可检测地减少可以表 示与治疗前的同一DMD或BMD患者中的肌酸激酶浓度相比减少5%、10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90% 或更多。
[0030] 肌纤维坏死可检测地减少优选在肌肉活检中评价，更优选如Hodgetts et al (Hodgetts S.，et al ,(2006),Neuromuscular Disorders, 16:591-602.2006)所述使用活 检横断面来评价。坏死可检测地减少可以是其中使用活检的横断面鉴定为坏死区域减少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。通过与治疗前的同一01?) 或BMD患者中评价的坏死比较来测量所述减少。
[0031] 肌纤维直径的同质性可检测地增加优选在肌肉活检横断面中评价，更优选如在 Hodgetts et al(Hodgetts S.,et al,(2006),Neuromuscular Disorders,16:591-602.2006)中所述评价。通过与治疗前的同一DMD或BMD患者中肌纤维直径的同质性比较测 量所述增加。
[0032] 可以通过对患者自身进行任何下述测定来评价一种或多种症状的缓解:将丧失行 走的时间延长、肌力的改善、举重物能力的改善、从地上站起来所需时间的改善、9米行走时 间改善、攀爬四层楼梯所需时间的改善、腿功能等级的改善、肺功能的改善、心脏功能的改 善、生活质量改善。这些测定中的每一种都是本领域技术人员已知的。举例而言，Manzur at al(Manzur AY et al,(2008),Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy(杜兴肌营养不良的糖皮质激素皮质甾类）（综述），Wiley publishers，The Cochrane collaboration·)的公开对这些测定中的每一种都给出大量的 说明。对于这些测定中的每一种，一旦发现测定中测量的参数可检测地改善或延长，则将优 选表示使用本发明方法已经缓解了个体的杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良的一种或多 种症状。可检测地改善或延长优选统计学上显著的改善或延长，如Hodgetts et al (Hodgetts S.，et al，（2006),Neuromuscular Disorders, 16:591-602.2006)所述。可选择 地，可以通过测量如本文后所定义的肌纤维功能、完整性和/或存活的改善来评价杜兴肌营 养不良或贝克肌营养不良一种或多种症状的缓解。
[0033] 本发明方法的治疗可以持续至少一周、至少一个月、至少七个月、至少一年、至少 2、3、4、5、6年或更长。
[0034] 如本文所定义的用于本发明的每个分子或寡核苷酸或其等同物都可以适用于向 受DMD或BMD影响的或有风险发展成DMD或BMD的个体体内的细胞、组织和/或器官直接给药， 并且都可以体内、离体或体外直接给药。本发明分子或寡核苷酸或组合物的给药频率可以 依赖于数个参数，例如患者年龄、患者突变、分子数(剂量）、所述分子的剂型。所述频率可以 在两周至少一次、或三周至少一次或四周至少一次或五周至少一次或更长的时间周期之间 改变。
[0035] 可以将分子或寡核苷酸或其等同物递送至细胞。当将所述分子、寡核苷酸或其等 同物给药至个体时，优选将它溶解在与递送方法相容的溶液中。对于静脉内给药、皮下给 药、肌内给药、膜内给药和/或心室内给药，所述溶液优选是生理盐水。特别优选的本发明方 法是使用赋形剂，所述赋形剂将进一步增强本文所定义的所述分子、寡核苷酸或其功能等 同物递送至细胞或细胞中，优选肌细胞。优选的赋形剂在题目为"药物组合物"的部分中界 定。
[0036]在本发明优选的方法中，使用能诱导和/或促进患者DMD前mRNA的另一个外显子跳 跃的其他分子。优选地，第二外显子选自：患者DMD前mRNA的外显子6、7、11、17、19、21、43、 44、45、50、51、52、53、55、57、59、62、63、65、66、69或75。可以使用的分子在表1-7中的任何一 个中有描述。这样，阻止了从该前mRNA产生包含DMD前mRNA两个或多个外显子的mRNA。该实 施方案也被称为双重或多重外显子跳跃（Aartsma-Rus A，Janson AA，Kaman WE，et al.Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense(杜兴肌营养不良的反义诱导的多重外显子跳跃更有意义）.Am J Hum Genet2004；74(1):83-92,Aartsma-Rus A,Kaman WE,ffeij R,den Dunnen JT,van 0mmen GJ,van Deutekom JC.Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within one or multiple exons (通过双重靶向一个或多个外显子来开发对杜兴肌营养不良治疗的外显子跳跃的前沿） .Mol Ther 2006; 14(3) :401-7)。在大多数情况下，双重外显子跳跃导致DMD前mRNA仅排除 两个靶向外显子。然而，在其他情况下，发现所述前mRNA中的靶向外显子和所述外显子之间 的全部区域在产生的mRNA中都不存在了，即使这些区域中存在其他外显子（其间的外显 子）。该多重跳跃显然是来自DMD基因的寡核苷酸组合的结果，其中将外显子45的一个寡核 苷酸和外显子51的一个寡核苷酸添加到转录DMD基因的细胞中。这种安排导致产生的mRNA 不包含外显子45-51。显然地，在所提及寡核苷酸存在的情况下，前mRNA的结构是这样的：刺 激剪接体系使外显子44和52彼此连接。
[0037]通过在两条互补的寡核苷酸之间提供连接，也有可能特定地促进其间的外显子跳 跃。因此，在一个实施方案中，通过连接部分使与至少两个抗肌萎缩蛋白外显子互补的核苷 酸区段分离。因此在该实施方案中，所述至少两段核苷酸连接形成单个分子。
[0038] 如果多于一个化合物或分子用在本发明方法中，则可以以任何顺序将所述化合物 给予个体。在一个实施方案中，所述化合物可以被同时给药(意思是在10小时之内，优选在1 小时之内给予所述化合物）。尽管如此，这是没有必要的。在另一个实施方案中，相继给予所 述化合物。
[0039] 泣f
[0040] 第二方面，提供了如前部分题目为"方法"所述的方法中使用的分子。如本文所定 义的分子优选寡核苷酸或反义寡核苷酸(Α0Ν)。
[0041] 本发明人发现，使用优选与外显子43、46、50-53中任何一个的至少8个核苷酸的连 续区段结合的分子，所述外显子被高频率地特异跳跃。尽管该效应与所述分子相对于结合 少于8个核苷酸的连续区段的分子的较高结合亲和力有关，但是可能有其他细胞内参数参 与促成杂交双链的热动力、动力或结构特征。在优选的实施方案中，使用与所述外显子中的 至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸的连续区段结合的 分子
[0042] 在优选的实施方案中，包含与DMD前mRNA的外显子43、46、50-53中的任何一个的一 部分互补的序列的本发明分子或寡核苷酸是这样的:所述互补部分至少是本发明寡核苷酸 长度的50%，更优选至少是60%，更优选至少是70%，更优选至少是80%，更优选至少是 90%或更优选至少是95%甚至更优选至少是98%和最优选高达100%。"所述外显子的一部 分"优选表示至少8个核苷酸的区段。在最优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸由与本文 所定义的所述外显子DMD前mRNA的一部分互补的序列组成。例如，寡核苷酸可以包含与本文 所定义的所述外显子DMD前mRNA的一部分互补的序列和其他侧翼序列。在更优选的实施方 案中，所述寡核苷酸的互补部分的长度至少为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50个核苷酸。优选地，其他侧翼序列用来修饰蛋白与所述分子或寡核苷酸的 结合，或用来修饰寡核苷酸的热动力特征、更优选地用来修饰靶RNA结合亲和力。
[0043] 用于本发明方法中的优选分子与选自下述核苷酸序列之一的至少8个核苷酸的连 续区段结合或互补：
[0044] 5 ' - AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAGGUCGGAUUGACAUUAU UCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGCCUGUGG-3'（SEQIDN0:2)用于外显子43的跳 跃；
[0045] 5'-UUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCA CUUG AACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC-3'（SEQ ID N0:3)用于外显子46的跳跃；
[0046] 5'-GGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCA GCCUG ACCUAGC UCCUGGACUGACCACUAUUGG-3'（SEQIDN0:4)用于外显子50的跳跃；
[0047] 5 ' - CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGU UACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUG UUGG