A分子的主链包含不带电 的磷酸基，因此PNA-RNA杂合体通常分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂合体更稳定(Egholm et al (1993)Nature 365,566-568)〇
[0073] 更优选的主链包括吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖由六元吗 啉环取代。最优选的核苷酸类似物或等同物包括磷酸二胺吗啉代寡核苷酸(ΡΜ0)，其中核糖 或脱氧核糖由六元吗啉环取代，并且邻近的吗啉环之间的阴离子磷酸二酯连接由非离子的 磷二酰胺连接取代。
[0074] 在另一个实施方案中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含磷酸二酯连接的一个 非桥氧的取代。该修饰轻微地使碱基对不稳定，但是显著增加了对核酸酶降解的抗性。优选 的核苷酸类似物或等同物包含硫代磷酸，手性硫代磷酸，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨烷基 磷酸三酯，H-磷酸酯，包括3 烃基亚磷酸酯、5 烃基亚磷酸酯和手性磷酸酯的甲基和其他 烷基磷酸酯，亚膦酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯，硫羰 氨基磷酸酯，硫羰烷基磷酸酯，硫羰烷基磷酸三酯，硒磷酸酯或硼烷磷酸酯 (boranophosphate)〇
[0075] 本发明的另一个优选的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个糖部分，其在2'、 3 '和/或5 '位置处单取代或双取代，例如-OH; -F;取代的或非取代的、线性的或分支的低级 (C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基、芳基或芳烷基，以上基团可以由一个或多个杂 原子打断;ο-、s-或N-烷基;ο-、s-或N-烯基;ο-、s-或N-炔基;0-、s-或N-烯丙基;0-烷基-o-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基;-氨基氧；甲乙氧基;-二甲氨基乙氧基；以及-二甲氨基乙烯乙 氧基。所述糖部分可以是吡喃糖或吡喃糖衍生物、或脱氧吡喃糖或脱氧吡喃糖衍生物、优选 是核糖或核糖衍生物、或脱氧核糖或脱氧核糖衍生物。这类优选的衍生化的糖部分包括锁 核酸(LNA)，其中2'-碳原子与糖环的3'或4'碳原子连接，因而形成双环糖部分。优选的LNA 包括2'-〇,4'_C-乙稀-桥核酸(Morita et al .2001 .Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242)。这些取代使得核苷酸类似物或等同物耐受RNase H和核酸酶，并增加了对靶RNA 的亲和力。
[0076]本领域技术人员应当理解，没有必要均匀地修饰反义寡核苷酸中的所有位置。此 外，可以将多于一个前述类似物或等同物并入单反义寡核苷酸中，或甚至并入反义寡核苷 酸的单一位置中。在某些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸具有至少两种不同类型的类 似物或等同物。
[0077] 本发明优选的反义寡核苷酸包含2'-0烷基磷硫酰反义寡核苷酸，例如2'-0_甲基 修饰的核糖(RNA)、2 '-0-乙基修饰的核糖、2 ' -0-丙基修饰的核糖和/或这些修饰的取代衍 生物，例如卤代衍生物。本发明最优选的反义寡核苷酸包含2'-0_甲基磷硫酰核糖。
[0078] 可将本发明分子的功能性等同物定义为本文所定义的寡核苷酸，其中至少在一定 程度上保留了所述功能性等同物的活性。优选地，所述功能性等同物的活性是诱导外显子 43、46、50、51、52或53跳跃，并提供功能性抗肌萎缩蛋白。因此优选地，通过检测外显子43、 46、50、51、52或53跳跃并通过确定功能性抗肌萎缩蛋白的数量来评价所述功能性等同物的 所述活性。本文优选将功能性抗肌萎缩蛋白定义为能与肌动蛋白和DGC蛋白复合物成员结 合的抗肌萎缩蛋白。对寡核苷酸所述活性的评价优选通过RT-PCR或免疫焚光或Western印 迹分析来进行。优选至少在一定程度上保留所述活性，此时，它表现出功能性等同物来源的 所述寡核苷酸相应活性的至少50%、或至少60%、或至少70%或至少80%或至少90%或至 少95 %或更高。遍及在本申请，当使用词语寡核苷酸时，它可以由本文所定义的其功能性等 同物代替。
[0079] 本领域技术人员应当理解，可以将不同的反义寡核苷酸组合，用于有效地跳跃人 DMD前mRNA的外显子43、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和/或外显子53中任何一 个。本发明包括使用一个、两个、三个、四个、五个或更多个寡核苷酸用于跳跃所述外显子之 一（即外显子43、46、50、51、52或53)。还包括使用至少两个寡核苷酸用于跳跃至少两个所述 外显子。优选跳跃两个所述外显子。更优选地，这两个外显子是：
[0080] -43和51，或
[0081] -43和53,或
[0082] -50和51，或
[0083] -51和52,或
[0084] -52和53。
[0085] 本领域技术人员会知道，根据DMD或BMD患者中存在突变的类型、数量和位置，跳跃 外显子的哪种组合是优选的。
[0086] 可以将反义寡核苷酸与增强所述反义寡核苷酸摄入细胞中，优选肌细胞中的部分 连接。这些部分的实例是胆固醇、碳水化合物、维生素、生物素、脂质、磷脂、细胞穿透肽(包 括但不限于触角足突变蛋白（antennapedia)、TAT、transportan以及诸如寡精氨酸、聚精氨 酸、寡赖氨酸或聚赖氨酸的带正电荷氨基酸）、诸如由抗体提供的抗原结合结构域、抗体的 Fab片段、或诸如骆驼状单结构域抗原结合结构域的单链抗原结合结构域。
[0087]优选的反义寡核苷酸包含肽连接的ΡΜ0。
[0088]当系统性递送时，包含本发明一个或多个核苷酸类似物或等同物的优选反义寡核 苷酸调节一个或多个包括心肌细胞在内的肌细胞中的剪接。在本方面中，包含特定核苷酸 类似物或等同物的反义寡核苷酸的系统性递送可能导致靶向肌细胞的子集，而包含不同核 苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸可能导致靶向肌细胞的不同子集。因此，在一个实施 方案中，优选使用包含不同核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸组合来诱导人DMD前 mRNA的外显子43、46、50、51、52或53跳跃。
[0089] 通过基于腺病毒或腺相关病毒的载体所提供的质粒来源的反义寡核苷酸表达或 病毒表达可以将能干扰必需序列的分子提供给细胞，这导致高效跳跃人DMD前mRNA的外显 子43、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52或外显子53。在优选的实施方案中，提供了 基于病毒的表达载体，其包含驱动本文所不分子表达的表达盒。表达优选由诸如U1、U6或 U7RNA启动子的聚合酶III启动子驱动。通过提供水性溶液中的质粒可以将所述质粒提供给 肌细胞或生肌细胞，用于反义寡核苷酸表达。可选择地，可以通过使用已知转染药剂的转染 来提供质粒，例如Lipof ectAMINE?2000( Invitrogen)或聚乙稀亚胺（PEI ;ExGen500(MBI Fermentas))或它们的衍生物。
[0090] 一个优选的反义寡核苷酸表达系统是基于腺病毒相联病毒(AAV)的载体。已经开 发出可以用于小反义核苷酸序列高效表达的基于单链和双链AAV的载体，用于高效跳跃DMD 前 mRNA 的外显子 43、46、50、51、52或53。
[0091] 优选的基于AAV的载体包含由聚合酶III-启动子(Pol III)驱动的表达盒。优选的 Pol III启动子例如是U1、U6或U7RNA启动子。
[0092] 因此，本发明还提供了基于病毒的载体，其包含用于表达本发明的一个或多个反 义序列的Pol ΠΙ-启动子驱动的表达盒，用于诱导人DMD前mRNA的外显子43、外显子46、外 显子50、外显子51、外显子52或外显子53跳跃。
[0093] 药物组合物
[0094]如果需要，通过添加药物可接受的载体可以将本发明的分子或表达反义寡核苷酸 的载体并入药学上有活性的混合物或组合物中。
[0095] 因此，另一方面，本发明提供了组合物，优选药物组合物，所述药物组合物包含含 有本发明的反义寡核苷酸的分子和/或表达本发明反义序列的基于病毒的载体分子和药物 可接受的载体。
[0096] 优选的药物组合物包含本文所定义的分子和/或本文所定义的载体，以及药物可 接受的载体或赋形剂，所述药物可接受的载体或赋形剂与能诱导DMD前mRNA的外显子6、7、 11、17、19、21、43、44、45、50、51、52、53、55、57、59、62、63、65、66、69 或 75 跳跃的本文所定义 的分子和/或载体任意组合。能诱导任何这些外显子跳跃的优选分子显示在表1-7的任一个 中。
[0097] 优选的赋形剂包括能形成递送本文所定义的这类分子的复合物、介质和/或脂质 体的赋形剂，优选将寡核苷酸复合在或捕获在囊泡或脂质体中通过细胞膜。这些赋形剂中 许多是本领域内已知的。合适的赋形剂包括聚乙醇胺和衍生物、或包括聚丙烯亚胺或聚乙 醇胺共聚物(PEC)和衍生物在内的相似的阳离子聚合物、ExGen 500、合成的两性物(SAINT-18)、lipofeCtinTM、DOTAP和/或能自我组装成颗粒的病毒衣壳蛋白，所述颗粒可以将这类 分子，优选本文所定义的寡核苷酸递送至细胞，优选肌细胞。这种赋形剂已经表现出有效地 将(寡核苷酸，例如反义)核酸递送至包括肌细胞在内的大量培养细胞中。它们的高转染潜 能与对总细胞存活的去除的低至中度的毒性结合。可以利用结构修饰的便利来对它们其他 的(体内）核酸转移特征或毒性进行进一步的修饰和分析。
[0098] Lipofectin代表脂质体转染试剂的实例。它由两种脂质组分组成，阳离子脂质N-[1-(2,3二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲基铵基氯化物(D0TMA)(化学纯（cp.)，D0TAP，其是 甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性组分介导细胞内释放。另一组递 送系统是聚合纳米颗粒。
[0099]聚阳离子，例如公知的作为DNA转染试剂的二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖，可以与氰 基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)结合，以配制成能将本文所定义的分子或化 合物，优选寡核苷酸穿过细胞膜递送入细胞中的阳离子纳米颗粒。
[0100]除了这些常用的纳米颗粒材料之外，阳离子肽鱼精蛋白为将本文所定义化合物， 优选的寡核苷酸配制成胶体提供了可选的方式。该胶状纳米颗粒系统可通过简单的自我组 装过程形成所谓的微粒(protic 1 es )，以包装和介导本文所定义的化合物，优选寡核苷酸的 细胞内释放。本领域技术人员可选择和修改任何上述的或其他可商购的可选择的赋形剂和 递送系统，来包装和递送本文所定义的化合物，优选寡核苷酸，用于在本发明中递送治疗人 杜兴肌营养不良或贝克肌营养不良的所述化合物。
[0101]此外，可以将本文所定义的化合物，优选寡核苷酸与特别设计的促进摄入细胞、细 胞质和/或它的核的靶向配基共价或非共价连接。这类配基可以包括（i)识别细胞、组织或 器官特异性元件促进细胞摄取的化合物(包括但不限于肽(_样)结构）和/或（ii)能促进本 文所定义的化合物的细胞摄取和/或细胞内释放的化合物，优选从诸如内涵体或溶酶体的 囊泡释放寡核苷酸。
[0102]因此，在优选的实施方案中，将本文所定义的化合物，优选寡核苷酸配制在药物 中，所述药物提供有至少一种用于递送的赋形剂和/或靶向配基和/或将所述化合物递送至 细胞和/或增强它的细胞内递送的递送装置。因此，本发明还包括药学上可接受的组合物， 其包含本文所定义的化合物，优选寡核苷酸且还包含至少一种用于递送的赋形剂和/或靶 向配基和/或将所述化合物递送至细胞和/或增强它的细胞内递送的递送装置。应当理解， 不可以将分子或化合物或寡核苷酸配制在一种单一的组合物或制剂中。根据它们的特性， 本领域技术人员会了解对于每种化合物哪种类型的剂型是最合适的。
[0103]在优选的实施方案中，使用的本文所定义的分子或寡核苷酸的浓度范围为0. ΙηΜ-1IZIM。更优选地，所用的浓度范围为0.3-400nM，更优选1-200ηΜ。可以以范围为0. l-20mg/kg 的剂量使用本文所定义的分子或寡核苷酸，优选〇.5-10mg/kg。如果使用数种分子或寡核苷 酸，这些浓度可以指寡核苷酸的总浓度或每种寡核苷酸的浓度。如上文给出的寡核苷酸浓 度的范围是体外或离体使用的优选浓度。本领域技术人员应当理解，根据所用的寡核苷酸、 待处理的靶细胞、基因靶标和它的表达水平、所用的培养基以及转染与孵育条件、所用的寡 核苷酸浓度可以进一步改变，并且需要进一步的优化。
[0104] 更优选地，用于在发明中预防、治疗DMD或BMD的化合物，优选寡核苷酸是通过合成 产生的，并且以配制在药学可接受的组合物或制剂中的形式直接给予细胞、组织、器官和/ 或患者。药物组合物至个体的递送优选通过一种或多种肠胃外注射实施，例如静脉内给药 和/或皮下给药和/或肌内给药和/或膜内给药和/或心室内给药，优选在人体的一个或多个 位点注射。
[0105] 当系统性递送时，任选地包含本发明的一种或多种核苷酸类似物或等同物的本文 所定义的优选寡核苷酸调节一个或多个包括心肌细胞在内的肌细胞中的剪接。本方面中， 包含特定核苷酸类似物或等同物的寡核苷酸的系统性递送可能导致靶向肌细胞的子集，在 本方面中，包含特定核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸的系统性递送可能导致靶向肌 细胞的子集，而包含不同核苷酸类似物或等同物的反义寡核苷酸可能导致靶向肌细胞的不 同子集。