受抑制 7,9。这个未经 充分鉴定的途径在脑缺血中的作用还未知，需要进一步的实验以阐明rhCl-INH神经保护作 用的机制。
[0154] rhClINH较pdClINH在缺血发生后时间窗中的良好神经保护作用可如下进一步解 释，即所述重组分子通过结合细胞表面抗原而更有效地靶向组织损伤部位和/或更有效的 组织穿透。需要进行更多的研究以充分阐明本发明所述观测结果的精确分子学机制。
[0155] Fluoro-Jade染色提供了损伤随着时间进展的间接证据。用rhCl-INH早期处理可 以完全挽救缺血半影区（海马和皮质）。处理给予得越晚，在缺血半影区就有越多的神经元 变性。这些发现证实rhCl-INH对于缺血半影区发挥神经保护作用。兔rhCl-INH能以剂量依 赖性方式降低缺血体积。功效时间窗实验中使用的rhCl-INH最有效的剂量(15U/小鼠，相应 于大约600U/kg)高于在人遗传性血管性水肿中的使用剂量(大约25-100U/kg)。为了证实较 低的剂量在降低神经变性和缺血性梗死中是否仍有效，进行剂量应答实验。结果示出400U/ kg(10U/小鼠）的rhCl-INH仍能显著减少缺血性损伤，但是程度降低。高于HAE所用剂量(5U/ 小鼠，200U/kg)8倍的剂量无效。这些发现与所表明的在各种炎症的治疗中需要大剂量Cl-INH的结果 5-致。特别是这种剂量是达到对内皮粘附分子的重要抑制作用所必需的6,这是 参与脑缺血/再灌注损伤病理学的一种机制。最后，在缺血之后3小时给予剂量为15U/小鼠 的牛rhCl-INH提供神经保护作用，但是显著低于兔rhCl-INH的神经保护作用。与盐水处理 的小鼠相比，所述牛来源的抑制剂也能改善神经损伤。这些发现表明这种分子能改善缺血 小鼠的一般状况。
[0156] 实施例3: rhCl INH与血浆衍生的Cl INH抑制经典途径和MBL途径的激活的能力对比
[0157] 材料与方法
[0158] rhCl INH 和pdClINH( Cetor，Sanquin ,Amsterdam ,The Nether lands)对于经典和凝 集素途径功能的作用在Wieslab TM complement system Screen(Euro_Diagnostica, Malmo ,Sweeden)中使用两种不同来源的血清来检测。一种血清是试剂盒中包含的血清，用 作阳性对照(后文称作血清样品1)。另一血清样品得自可商购人血清库(25个不同供体的血 清库;K 〇rdia，Leiden，荷兰），后文称作血清样品2。将这两个血清样品一式三份单独与0、 15、30和75μπιο1 rhCl INH或pdCl INH在室温保温30分钟。为此，将pdCl INH和rhCl INH原液在 水中稀释为适当浓度。取相应于15、30和75μπιο1 rhClINH或pdClINH的体积，用水调节为15μ 1。取与rhClINH相同稀释度的溶解有rhClINH的缓冲液(20mM柠檬酸盐，0· 19Μ蔗糖pH 6·8; 经0.22μπι滤膜过滤)作为对照以干扰Wieslab补体系统。根据厂商指导，将经典途径和MBL途 径的阳性对照(PC)和阴性对照(NC)(试剂盒中提供)及两种血清样品在稀释剂CP(经典途 径）和稀释剂MP(MBL途径）中稀释为1/101。为127.5μ1这些稀释的血清补加22.5μ1水、 ?(1(：11順、沾(：11順或者缓冲液，在室温保温30分钟。接着，将10(^1/孔的？(^(：、稀释剂0?或 MP(空白）及样品移液至合适的平板上，在37°C保温1小时。在保温后，用300μ1/洗涤溶液将 孔洗涤3次，随后在室温与100μΙ/孔的结合物保温30分钟。再次洗涤后，将孔与100μΙ/孔的 底物再次在室温保温30分钟。通过加入100μΙ/孔的5mM EDTA终止反应，在405nm读取吸光 度。
[0159] 为了计算结果，从PC、NC和样品组中减去空白组(稀释剂CP或MP)的吸光度。补体激 活的百分比利用如下公式计算：（样品-NC)/(PC-NC) X 100。这意味着PC总是设定为100%。 对于每种条件，计算平均值、标准偏差及CV%。
[0160] 结果
[0161] 通过Wielisa检查rhClINH和pdClINH对经典途径的作用
[0162] 在两个不同血清样品中分析rhClINH和pdClINH对经典途径激活的抑制作用。如图 12、13和16所示，^1(：1預!1和?(1(：1預!1在这两个血清样品中均剂量依赖性降低经典途径介导 的C5b-9沉积。而75μπι浓度的rhClINH与pdClINH相比似乎在血清样品1中略强地抑制经典途 径激活，这种作用在血清样品2中未观测到。在所有其它测试浓度，在rhCl INH与pdCl INH之 间未观测到抑制作用的差异。因此，推断rhCl INH和pdCl INH在人血清中抑制经典途径激活 方面效果相同。
[0163] 通过Wielisa检查rhClINH和pdClINH对MBL途径的作用
[0164] 在相同的实验设置中，分析rhClINH和pdClINH对MBL途径激活的抑制作用。如图 14、15和16所示，rhCl INH和pdCl INH也均剂量依赖性降低MBL途径的激活。然而，与其中未观 测到差异的经典途径相反，rhClINH与pdClINH相比呈现出是MBL途径的更强的抑制剂。在所 有三个测试浓度及在这两个血清样品中，rhClINH-介导的MBL途径的抑制比pdClINH高~ 20%。因此，推断rhClINH与pdClINH相比是MBL途径的更有效的抑制剂。
[0165] 结论
[0166] 结果示出rhCl INH和pdCl INH在抑制经典途径中效果相等，但是rhCl INH是MBL途径 的更强的抑制剂。在所有测试浓度，rhClINH比pdClINH介导的MBL途径抑制强~20%。
[0167] 参考文献
[0168] I.De Simoni,M.G.et al.Neuroprotection by complement(Cl)inhibitor in mouse transient brain ischemia.J Cereb Blood Flow Met 23,232-239(2003).
[0169] 2.De Simoni,M.G.et al. The powerful neuroprotective action of Cl-inhibitor on brain ischemia-reperfusion does not require CIq.Am JPathol 164, 1857-63(2004).
[0170] 3.Storini,C.et al. Cl inhibitor protects against brain ischemia-reperfusion via inhibition of cell recruitment and inflammation.Neurobiol Disease 19,10-17(2005).
[0171] 4.Schmued,L.C.&Hopkins,K.J.Fluoro-Jade B:a high affinity fluorescent marker for the localization of neuronal degeneration.Brain Res 874,123-30. (2000).
[0172] 5.Caliezi,C.et al.Cl esterase inhibitor:an anti-inflammatory agent and its potential use in the treatment of diseases other than hereditary angioedema.Pharmacol Rev 52,91-112(2000).
[0173] 6.Cai,S.et al.A direct role for Cl inhibitor in regulation of leukocyte adhesion.J ImmunoII74,6462-6(2005).
[0174] 7.ffalsh,M.C.et al .Mannose-binding lectin is a regulator of inflammation that accompanies myocardial ischemia and reperfusion injury.J Immunol 175,541-6(2005).
[0175] 8·Mo 11er-Kristensen,M·et al.Mannan-binding lectin recognizes structures on ischaemic reperfused mouse kidneys and is implicated in tissue injury.Scand J Immunol 61,426-34(2005).
[0176] 9.Hart,Μ.L.et al.Gastrointestinal ischemia-reperfusion is lectin complement pathway dependent without involving CIq.J Immunol 174,6373-80 (2005).
【主权项】
1. 血浆半衰期小于6小时的Cl抑制剂在制备用于预防、降低或治疗对象中至少一种缺 血和再灌注损伤的药物组合物中的应用，其中所述C1抑制剂获得自转基因非人动物，且所 述C1抑制剂在至少一种预见的缺血和再灌注损伤发生之前给予。2. 权利要求1的应用，其中所述C1抑制剂获得自转基因非人动物的乳汁。3. 权利要求2的应用，其中所述转基因非人动物是牛或者Lagomorpha目的动物，优选 兔。4. 权利要求1的应用，其中所述C1抑制剂以50-2000单位/kg体重范围的量被应用。5. 权利要求1的应用，其中所述药物组合物还含有溶血栓药或者与溶血栓药组合应用 或者在用这种溶血栓药治疗后应用。6. 权利要求1的应用，其中所述C1抑制剂在至少一种预见的缺血和再灌注损伤发生之 前至多3小时、优选至多2小时、更优选至多1小时、最优选至多30分钟给予，和/或其中所述 C1抑制剂被持续给予需要其的对象和/或在器官移植情况中被持续给予待移植的器官。7. 权利要求1的应用，其中预见的缺血和再灌注损伤的发生是器官移植。8. 权利要求1的应用，其中所述药物组合物用于预防、降低或治疗已知通过凝集素途径 产生的至少一种缺血和再灌注损伤，优选心肌、肾、胃肠道缺血和再灌注损伤或中风。9. 权利要求1的应用，其中C1抑制剂在海马和/或皮质中发挥神经保护作用。
【专利摘要】本发明涉及C1抑制剂在预防、降低和治疗缺血和再灌注损伤中的治疗和预防性应用。本发明的C1抑制剂在缺血和再灌注后给予仍具有治疗作用，并因此特别可用于无法预见的缺血-再灌注的发生如中风。
【IPC分类】A61P25/00, A61K45/06, A61P9/10, A61P9/00, A61K38/57
【公开号】CN105641688
【申请号】
【发明人】M·曼奈斯, J·H·努延斯, F·皮珀, M·G·德西莫尼, G·J·齐瑞
【申请人】法明知识产权股份有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2006年12月19日