C1抑制剂在预防缺血-再灌注损伤中的应用
【专利说明】C1抑制剂在预防缺血-再灌注损伤中的应用
[0001 ] 本申请是申请日为2006年12月19日的第200680048287.9号发明名称为"C1抑制剂 在预防缺血-再灌注损伤中的应用"的中国专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及Cl抑制剂在预防、降低和治疗缺血-再灌注损伤中的治疗和预防性应 用，特别在由于中风的结果而发生的脑缺血-再灌注损伤中的应用。
[0003] 发明背景
[0004] 缺血-再灌注损伤是一种熟知的发生中的（occuring)病理状况。其可以是预见的 病理状况或者无法预见的病理状况。中风是一种最常见的无法预见的缺血-再灌注损伤。中 风是工业化国家中导致死亡的第三大因素，导致长期伤残。中风是一种典型的心血管疾病， 影响通向脑部或者脑内的动脉。当这种动脉被血栓阻塞或者破裂时发生中风，导致由所述 阻塞的动脉供养的脑组织缺血。对脑的直接损害是由于血流中断所致，主要是由于丧失维 持组织存活的氧化作用，如果不能逆转而最后导致梗塞形成所致。然而，如果所述损害是可 逆的（自然或经治疗而逆转），则缺血组织的再灌注可自相矛盾地导致进一步的间接损害。 当存在长期缺血时，得自单独缺氧的"直接"损害是主要机制。对于较短时间的缺血，间接或 再灌注介导的损害令人感兴趣地成为对于最终的结果更重要的因素。
[0005] 据报道补体Cl的抑制剂-Cl抑制剂(ClINH)在啮齿动物的脑缺血-再灌注模型中通 过降低缺血-再灌注损伤而展示神经保护作用（De Simoni et al, 2003，J Cereb Blood Flow Metab.23:232_9;Akita et &1.，2003，此111'〇811找6^52:395-400)。〇11順对于脑缺 血-再灌注损伤的神经保护作用不需要CIq(De Simoni et &1·，2004，Απι J Pathol.164: 1857-63)。最近，Storini等（2005，Neurobiol Dis. 19:10-7)报道了ClINH通过抑制炎症和 细胞从血管系统中募集至缺血部位而对缺血-再灌注损伤发挥抗炎和抗凋亡作用。然而，给 予ClINH有疗效的中风周时间窗较窄。因此，本发明的一个目的是提供具有较宽给药时间窗 的 Cl IML
[0006] 发明描述
[0007] 本发明基于令人惊奇的发现，即在小鼠短暂局灶性脑缺血模型中，天然存在的血 浆衍生的Cl抑制剂(ClINH)在缺血之后给予时丧失其大部分降低缺血-再灌注损伤的能力， 而重组的ClINH制备物在缺血和/或再灌注至少1小时后注射仍能发挥其神经保护作用。令 人惊奇地，当在缺血和/或再灌注后18小时注射时，仍能达到神经保护作用。天然存在的血 浆衍生的Cl INH与重组Cl INH制备物的差异是前者血浆半衰期为至少24小时并且是完全唾 液酸化的糖蛋白，后者具有降低的血浆半衰期并且具有与血浆产物不同的糖基化。
[0008] 天然存在的血浆衍生的Cl INH与重组Cl INH制备物之间的已知差异是糖基化的程 度和类型。重组的糖蛋白含有大量不同的N-聚糖，包括寡甘露糖型、杂合型和复合型结构， 而血浆衍生的ClINH的N-聚糖主要由完全唾液酸化的复合型结构组成。由于糖基化的不同， 因此血浆衍生的糖蛋白的血浆半衰期为至少24小时，而重组ClINH具有降低的血浆半衰期。
[0009] 因此，本发明的一方面涉及预防、降低或治疗至少一种缺血和再灌注损伤的方法， 其中Cl抑制剂在缺血和/或在再灌注之后被给予。所述方法优选包括给予有效量的血浆半 衰期比血浆衍生的ClINH的半衰期短的ClINH的步骤。或者，所述方法优选包括给予有效量 的具有与血浆衍生的ClINH不同的糖基化的ClINH的步骤。这种方法涉及Cl抑制剂在预防、 降低和/或治疗任何类型的缺血-再灌注损伤中的治疗和/或预防性应用。
[0010] Cl抑制剂，也称作Cl酯酶抑制剂，在本文是指补体Cl的抑制剂。ClINH属于丝氨酸 蛋白酶抑制剂超家族，是补体系统的Cir和CIs的唯一抑制剂，且是接触系统的因子XIIa和 激肽释放酶的主要抑制剂。另外，ClINH还抑制凝血和纤溶系统的其它丝氨酸蛋白酶，如因 子XI、组织血纤维蛋白溶酶原激活物和纤溶酶（Schapira et al.1985,Complement 2:111; Davis, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6:595)。人ClINH是由500个氨基酸组成的蛋白质，包括一个 22个氨基酸组成的信号序列（Carter et al. 1988,Euro.J.Biochem. 173; 163)。血浆ClINH 是分子量为大约76kDa及大量糖基化的糖蛋白，其分子量中接近26%由碳水化合物组成 (Perkins et al. ,1990，J.MoI .Biol .214,751)。用于本发明方法中的ClINH优选是具有与 SEQ ID N0:1所示成熟人ClINH的氨基酸序列具有至少65、67、68、69、70、75、80、85、90、95、 98或99%相同性的氨基酸序列的蛋白质。
[0011] 对于本发明而言，两个氨基酸序列之间的相同性程度是指两个序列之间相同的氨 基酸的百分比。首先，使用如 Altschul，et al. ,J.MoI.BioL· 215:403-410( 1990)所述 Basic Local Alignment Search TooI(BLAST)算法检索同源多肽序列。进行BLAST分析的软件可 公开得自美国国家生物技术信息中心( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。BLAST算法参数 W、B和E决定了序列排列对比的灵敏性和速度。BLAST程序使用默认参数：字长(W) = 3， BL0SUM62 评分矩阵（scoring matrix)(见 Henikoff&Henikoff, Proc.Natl .Acad.Sci .USA89:10915( 1989))序列对比（B) = 50,期望值(E) = 10，M = 5，N=_ 4。接着，使用C1USTALW排列对比算法(Higgins D.et al(1994) .Nucleic Acids Res.22: 4673-4680)，利用如下参数确定同源序列的相同性程度（如上述）：缺口大小：5，缺口开放 (Gap open): 11，缺口延伸（Gap extension) :1，错配：_15,字大小：3。
[0012] ClINH优选具有可例如由Drouet et al.( 1988,Clin Chim Acta.174:121-30)所 述测定的ClINH活性。更优选地，ClINH是人ClINH(hCHNH)，意味着所述ClINH具有在人体内 天然存在的氨基酸序列（例如SEQ ID NO: 1或CAA30314所示），但是不意味着所述ClINH是在 例如人血浆中产生或得自人血浆。
[0013]根据本发明的一个方面，本发明方法中使用的ClINH优选具有比血浆衍生的ClINH 的血浆半衰期短的血浆半衰期，更优选本发明的ClINH血浆半衰期低于得自人血浆的ClINH 的血浆半衰期。"降低的血浆半衰期"是指本发明ClINH的循环半衰期相对于血浆衍生的 ClINH的循环半衰期的负向变化。在本文中，血浆衍生的ClINH是指天然存在的ClINH，其典 型得自血浆且可以从血浆中纯化，但是未经化学或酶修饰。
[0014] 血浆半衰期是通过在给予Cl INH之后不同时间点取血样，并确定每个样品中Cl INH 的浓度而测量。血清浓度与时间的相关性也可以用于计算血浆半衰期。本发明ClINH的血浆 半衰期比血浆衍生的ClINH的循环半衰期优选降低至少2倍、3倍、4倍、6倍，更优选降低至少 大约8倍，最优选降低至少大约10倍。换句话说，本发明Cl INH的血衆半衰期优选低于血衆衍 生的ClINH(即其天然存在的对应物）的血浆半衰期的60、50、40、30、25、20、15、12.5或10%。 [0015]例如，本发明的实施例中应用的ClINH(得自转基因兔的乳汁）的血浆半衰期在人 体内为大约3小时，比血浆衍生的ClINH在人体内的平均血浆半衰期低大约4-8倍。应理解的 是本发明ClINH比血浆衍生的ClINH的血浆半衰期降低的测定优选在相似条件(如果不是相 同条件)下进行，即优选在相应的剂量、样品、相同的生物体(可以是实验室动物如小鼠或人 对象)及相同数量的测试对象的条件下进行。另外，可以通过标准统计学分析方法对比这两 种Cl INH制备物的平均血浆半衰期。
[0016] 可以通过任何常规方法制备具有更短半衰期的C1INH，无论是天然发生还是重组 产生的C1INH。例如可以在重组宿主细胞或生物体中体内制备，获得具有修饰的碳水化合物 结构的C1INH(与血浆衍生的ClINH相比），或者天然存在的ClINH的碳水化合物结构可以在 体外经化学或酶修饰。优选地，与血浆衍生的Cl INH相比本发明的ClINH通过如下方式进行 修饰：（从糖蛋白的天然存在的变体或重组表达的变体中）除去碳水化合物成分，优选从N-连接的碳水化合物链中除去唾液酸和/或半乳糖，和/或除去碳水化合物链从而暴露甘露 糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和/或岩藻糖残基。
[0017] 根据本发明的另一方面，本发明方法中应用的ClINH优选具有与血浆衍生的ClINH 不同的糖基化。对本发明ClINH的碳水化合物结构进行的修饰包括导致低糖基化、过糖基化 至无唾液酸(asialio)形式ClINH的修饰，或者导致不同糖基化模式的任何其它修饰。
[0018] 体外低糖基化可以是缺失ClINH的碳水化合物成分或者全部碳水化合物链的结 果。修饰可包括对N-或0-连接的碳水化合物链或者仅一种类型的链进行修饰。可包括对所 有链或者仅一些链进行修饰。过糖基化可例如是向ClINH分子中添加额外的碳水化合物成 分或者完全的碳水化合物链的结果。无唾液酸形式的ClINH或者末端唾液酸残基水平降低 形式的ClINH可典型通过除去唾液酸基团而获得。本领域熟知血液中糖蛋白的半衰期高度 依赖于其N-和0-连接的碳水化合物基团的成分和结构。通常地，糖蛋白的最大半衰期要求 其N-和0-连接的碳水化合物基团具有末端唾液酸。如果这个末端唾液酸不存在，则所述糖 蛋白由于半乳糖残基暴露而被迅速从血液中清除。已经充分确定糖蛋白的碳水化合物成分 中末端半乳糖残基的存在导致肝脏中唾液酸糖蛋白受体对其的血浆清除率增强。因此，在 优选的实施方案中，本发明方法中应用的C11NH优选具有较血浆衍生的人C1抑制剂降低水 平的末端唾液酸残基。唾液酸可以通过一些方式除去。例如，可以通过化学或酶处理方法除 去，例如通过用唾液酸酶处理而除去。适于这个目的的唾液酸酶由Chou et al.(1996,J Biol Chem.271. (32) :19219-24;and 1994,J Biol Chem.269(29) :18821-6)描述，可例如 得自V-Iabs，Inc. (Covington，Louisiana ,USA)。在另一个优选的实施方案中，本发明方法 中应用的ClINH优选具有暴露的甘露糖、N-乙酰葡糖胺磷酸甘露糖、半乳糖和/或N-乙酰半 乳糖胺残基。暴露的糖残基通常是位于聚糖分支上的末端糖残基或者至少是可易于与对所 述残基具有亲和性的成分相互作用的糖残基(如碳水化合物结合结构域）。具有暴露的半乳 糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、岩藻糖或磷酸甘露糖残基的ClINH可例如通过 用如下一或多种酶进行酶