对比，当在缺血后1小时注射后者时，其 几乎完全丧失发挥神经保护作用的能力(见图2)。
[0117] 这项研究的主要结果如下：
[0118] 1.小鼠血浆中rhClINH的半衰期为大约3小时(在15U/小鼠的剂量）。抗原与功能活 性之间的良好相关性表明所述重组蛋白质在血浆中仅以其活性形式循环;可能是组织分布 有助于血浆水平的降低。
[0119] 2.15U/小鼠-pre剂量的rhClINH非常有效地降低缺血体积(降低69% )。
[0120] 3.通过染色评价，15U/小鼠的剂量的rhCl INH能明显降低海马中的变性神经元数， 因此表明缺血体积的降低归因于神经元免于损伤。
[0121] 4.当在缺血开始(_前）、结束(_后）或缺血发生1小时后（Ih后后，即再灌注开始30 分钟)给予时，rhClINH在降低缺血体积方面作用相似。因此，rhClINH较pdClINH(当在缺血1 小时后给予PdCl INH时其不再起作用）的作用功效时间窗宽大。
[0122] 5.rhClINH-前剂量的神经保护作用时长期的，通过在缺血开始后7天进行的神经 元计数而示出。
[0123] 6.在缺血之后48小时评价发现，rhCHNH使得总体和局灶性功能缺损略为改善。这 个发现与用PdClINH观测到的结果相似。为了评估rhClINH对于长期行为功能表现的影响， 我们通过旷场实验分析了小鼠的行为。结果示出缺血之后7天rearing行为在缺血小鼠中比 未经试验的小鼠中的得分显著降低。这种降低在rhClINH处理的小鼠中不存在，其得分与对 照小鼠无差异。
[0124] 7.在早期(48小时）和晚期(7天)时间点进行评价，示出rhCl INH能削弱缺血小鼠脑 组织中小胶质细胞/巨噬细胞的激活/募集。这些细胞是脑组织炎症应答的标志。
[0125] 8.在48小时由缺血激发的星形胶质细胞的强应答由rhCl INH削弱。在两个实验组 中星形胶质细胞激活均明显降低，在盐水和rhClINH-处理的小鼠中可观测到无差异。
[0126] 实施例2:对rhCl -INH在局灶性脑缺血的小鼠模型中的神经保护作用的研究
[0127] 我们先前已经证实了 15U的rhCl-INH在小鼠脑缺血/再灌注模型中具有明显的神 经保护作用，当在缺血/再灌注发生之后1小时给予时也如此，而PdCl-ENH在治疗后这个时 间点不再有效。这种神经保护作用是长期的，事实上在缺血及治疗之后7天，用rhCl-INH治 疗的小鼠缺血的脑组织仍示出梗死面积降低。在如下实验中，我们确定了rhCl-INH的神经 保护作用对缺血体积的功效时间窗(超过1小时后)和剂量应答。另外，我们使用相同方案直 接对比了 pdCl-INH、兔和牛rhCl-INH的作用(对于兔rhCl-INH是在最有效剂量和时间点）
[0128] 方法
[0129] 动物
[0? 30] 涉及动物及其照顾的程序根据符合国家(D · L.n.ll6，G.U· suppl · 40，18February 1992)和国际法和政策（EEC Council Directive 86/609,0J L 358,1 ;Dec. 12,1987;NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,U.S.National Research Council 1996)的研究机构指导进txD将雄性C57B1/6小鼠（26_28g，CharIes River，Calco， Italy)圈养，5只/笼，保持在恒定的温度（21 ± TC)和相对湿度（60%)，规律光照/黑暗 (7am_7pm)。随意取食(小鼠食用Altromin颗粒)和水D
[0131] 一过性局灶性脑缺血
[0132] 如前所述通过大脑中动脉闭塞(MCAO)实现缺血1>3。利用含5%异氟醚的Na0/0a (70/30%)混合物诱导麻醉，并用在相同混合物中的1.5-2%异氟醚保持麻醉状态。为了证 实每只动物中血管闭塞的合适性，通过激光多普勒血流仪(Transonic BLF-21)使用位于脑 表面并用压模材料固定在颜骨上的柔软的0.5mm光纤探头(Transonic，Type Μ,0.5mm直径） 测量血流，使用如下坐标:AP = -1 mm，L = - 3,5 mm。简而言之，暴露右颈总动脉，通过在颈总动 脉上做的切口将硅丝(7-0)导入颈内动脉中并行进至大脑前动脉，以阻断其分支进入大脑 前动脉和MCA。使所述硅丝行进直至观测到与缺血前基线相比血流减少>70%。在缺血30分 钟后，小心除去所述尼龙丝恢复血流。
[0133] 药物治疗
[0134] 在缺血后不同时间以不同剂量给予小鼠单剂量静脉内注射Cl-INH(兔rhCl-INH、 牛rhCl-INH或者pdCl-INH)。对照小鼠接受相同体积的盐水。
[0135] 神经功能缺损评估
[0136] 在缺血48小时后，由有经验的未知实验条件的研究人员针对小鼠独特的两项神经 功能评分对每只小鼠进行评估。总体神经功能缺损小鼠的每一项如下类别的得分为0-28: 毛发、耳、眼、姿势、自发活动、癫痫行为。局灶性神经功能缺损小鼠的每一项如下类别的得 分为0-28:身体对称性、步态、攀爬、旋转行为、前肢对称性、强制性旋转、感觉应答。数据以 中位值和百分位值表示。
[0137] 梗死面积的量化
[0138] 在缺血48小时后，将小鼠用Equi tens in (120μ1/小鼠，腹膜内注射)深度麻醉，经心 灌注30ml的PBS 0.1mol/l、pH 7.4,随后灌注在PBS中的60ml冰冷多聚甲醛(4%)。在从颅腔 中小心取出脑之后，将其移至30%蔗糖的PBS溶液中，在4°C低温保护过夜。然后将脑沉浸在 异戊烷中在_45°C速冻3分钟，之后密封于小瓶中，在-70°C贮存直至使用。为了确定损伤面 积，以240μηι间隔依次制作厚度为20μηι的脑冠状切片，用中性红（Neutral Red Gurr Certi stain, BDH ,England)染色。在每个切片上，梗塞面积经盲式评价并通过组织学染色的 相对苍白度(relative paleness)而描绘。梗塞面积通过从每个切片上的对侧半球的面积 中减去同侧半球中的正常组织面积而确定。通过使用计算机辅助图像分析仪并通过图像分 析系统(Analytical Image System)计算进行量化，综合每个脑组织切片上的梗塞面积而 计算梗死体积。
[0139] 神经变性的评价
[0140]通过用Fluoro-Jade4染色（这是神经元变性的标志物)在厚度为20μηι的切片上评 估神经变性的存在。简而言之，将切片干燥，在乙醇（100%-75% )和蒸馏水中再水化。然后 将其在0.06%高锰酸钾中保温15分钟，在蒸馏水中洗涤，移至0.001%Fluor〇-Jade染色溶 液中染色30分钟。在染色后，将切片在蒸馏水中漂洗，干燥，浸入二甲苯中，用DPX封固剂 (BDH，P 〇〇le，UK)封盖，之后进行荧光显微镜分析。
[0141] 结果
[0142] 短暂缺血中的功效时间窗
[0143] 为了评估功效时间窗，从缺血开始后3、6、9、18和24小时给予15U的兔rhCl-INH或 盐水。48小时后，在缺血发生后3和6小时用兔rhCl-INH3处理的缺血小鼠比用盐水处理的缺 血小鼠（44.43 ± 5.94mm3)示出缺血体积明显降低（分别为11.71 ± 0.63mm3和20.38 土 2.37mm3)。当在缺血后9和18小时给予兔rhCl-INH时，其仍有效，但是功效较小（分别为 23.63 ±4. Ilmm3和27.13 ±2.58mm3)。在缺血后24小时给予时，该抑制剂丧失其有益作用 (41.92±2.76mm 3)(图3)。在盐水处理的小鼠中，Fluoro-Jade染色示出在纹状体皮质和海 马中存在神经变性。当在早期时间点给予时，rhCl-INH能减少海马(直至3小时)和皮质(直 至9小时）中的神经变性。当在缺血后6和9小时用这种抑制剂处理小鼠时，在海马中观测到 一些变性神经元。在稍后的处理时间点（18和24小时），当缺血体积较大时，Fluoro-Jade染 色示出在皮质中存在神经变性的神经元。在所有测试时间点，在盐水和rhCl-INH处理的动 物中纹状体均示出广泛的神经变性（图5、6、7)。由未知实验条件的研究人员对每只动物进 行Fluoro-Jade染色半定量评估（图4) 〇
[0144] 短暂缺血中的剂量应答
[0145] 由于在人遗传性血管性水肿中使用的Cl-INH剂量低于本发明在小鼠中风治疗中 的用量，因此在本发明的缺血模型中使用较低的剂量。基于先前的实验结果，选择处理后3 小时进行剂量应答实验。在缺血和再灌注发生后3小时给予不同剂量的兔rhCl-INH(5和10 单位KlOU/小鼠的剂量在降低缺血体积方面仍有效(22.10±3.65mm 3)i5l^*rhCl-INH 不再改变脑损伤的程度(47.39±4.08mm3)。这些数据示出兔rhCl-INH能以剂量依赖性方式 改变缺血损伤(图8)。
[0146] 在用IOU rhCl-INH处理的小鼠中，通过Fluoro-Jade染色在纹状体观测到一些神 经变性的神经元，但在海马和皮质中未观测到；而用5U处理的缺血小鼠在纹状体皮质中出 现大量神经变性(数据未示出）。
[0147] 在功效时间窗或剂量应答实验中均未示出总体和局灶性神经功能缺损的任何明 显变化(数据未示出）。
[0148] pdCl-INH与rhCl-INH(来自兔和牛)作用的对比
[0149] 先前关于pdCl-INH的数据得自一种不同的短暂脑缺血模型。为了直接对比pdCl-INH、牛rhCl-INH和兔rhCl-INH，将这些化合物给予使用相同实验方案(硅涂覆的丝)诱导的 缺血小鼠。在缺血发生后3小时给予剂量为15U/小鼠的所述抑制剂。
[0150] 正如所预期的，pdCl-INH在此时间点不能发挥神经保护作用（47.39±4.08mm3)。 然而，牛rhCl-INH-处理的缺血小鼠较盐水处理的小鼠示出明显降低的缺血体积，但是程度 较兔rhCl-INH-处理的小鼠低（图9)。令人惊奇的是总体和局灶性神经功能缺损均通过牛 rhCl-INH得以改善（图10)。
[0151] Fluoro-Jade染色示出在用pdCl-INH处理的缺血小鼠脑组织的所有考虑的区域 (皮质、纹状体和海马）中均存在大量神经变性。牛rhCl-INH处理的小鼠脑组织染色示出皮 质和海马中不同程度的神经变性，因为在6只小鼠中有3只小鼠在这两个区域均观测到明显 的神经变性，而其它3只小鼠的神经变性量很少。在6只小鼠中均示出纹状体广泛的Flu oro-Jade染色。
[0152] 评论
[0153] 这项工作的最相关数据是兔rhCl-INH的功效时间窗。剂量为15U/小鼠的兔rhCl-INH在缺血发生之后直至18小时仍能显著降低缺血体积，而pdCl-INH在缺血3小时之后已经 丧失其神经保护作用。这个令人惊奇的特征使得rhCl-INH成为人类中风治疗的一种可能的 候选物。Pd和rhCl-INH的不同功效可归因于这两种分子的不同糖基化，导致与血浆衍生的 Cl-INH相比rhCl-INH对于甘露糖结合蛋白（MBP)的亲和性较高。通过与MBP的结合，rhCl-MH 导致参与心、肾和胃肠道缺血/再灌注损伤发病机制的补体凝集素途径