处理而获得:β-D-N-乙酰己糖胺酶、内-β-D-半乳糖苷酶和/或α-D-N-乙酰氨基半乳糖苷酶（也可得自例如V-Iabs，Inc ·，Covington，Louisiana，USA) 〇
[0019] 对ClINH的碳水化合物链的体内修饰可以通过使用重组生产系统进行。可以使用 原核细胞和真核细胞培养物，如酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。例如，COS 细胞和CHO细胞是合适的哺乳动物生产系统。尽管哺乳动物细胞培养系统有能力产生具有 唾液酸化的碳水化合物基团的糖蛋白，但是通常难以实现理想的天然或完全的糖基化，因 此重组产生的糖蛋白通常具有与其天然对应物不同的糖基化模式。通常这种不同的糖基化 模式是不完全的（与天然对应物相比），具有暴露的半乳糖、N-乙酰葡糖胺和/或甘露糖残 基。另外，在真核微生物如酵母或真菌中产生ClINH将获得具有暴露的甘露糖残基的C1INH。
[0020]具有修饰的碳水化合物结构的Cl INH也可以在转基因动物中制备，优选在非人动 物中制备，如在转基因兔、牛、小鼠、大鼠、山羊和绵羊中。优选这种糖蛋白在这些非人转基 因动物的乳腺中表达，由此所述糖蛋白可以得自所述动物的乳汁。本领域技术人员已知这 将依赖于产生的特异性糖蛋白及产生的量、最适用于生产的转基因动物。特别优选用于本 发明的Cl INH是得自转基因牛或者兔(Lagomorpha)目动物的乳汁的ClINH，所述兔目动物优 选Leporidae科，更优选是Oryctolagus属，最优选是Oryctolagus cuniculus种。
[0021 ]与其天然的血浆衍生的对应物相比，对ClINH蛋白的碳水化合物链的结构进行的 不同类型的修饰可得自重组生产系统，例如可以同时或连续地单独或者组合导入不同的糖 基化、低糖基化或过糖基化，一些修饰可以导入所述分子的一部分中，另一些修饰可以导入 所述分子的另一部分中。有助于所述蛋白质的治疗功效的优选的修饰组合包括本发明 ClINH上的表达的半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、岩藻糖和/或磷酸甘露 糖残基。本发明的ClINH可以例如具有寡甘露糖型聚糖或者高甘露糖型聚糖。优选ClINH上 的聚糖的至少大约5、10、15、20、40或60%的末端残基选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰 葡糖胺、甘露糖、岩藻糖和磷酸甘露糖残基。例如，用于本发明中的优选ClINH含有比其天然 对应物少大约2、4、5、6-倍的唾液酸，和/或其至少大约5、10、15、20、40或60 %的N连接的聚 糖是中性的，携带具有平伏的3-和4-OH基团的末端己糖，如甘露糖和N-乙酰葡糖胺。相反， 血浆衍生的Cl INH无寡甘露糖型糖基化。用于本发明中的优选Cl INH例如是在兔乳腺中产生 的重组人Cl INH，其比天然对应物缺少5-6倍的唾液酸，其大约15 %的N-连接的聚糖是中性 的，携带末端甘露糖残基。
[0022] 在一个优选的实施方案中，用于本发明中的ClINH的不同糖基化导致对甘露糖结 合蛋白具有比其血浆衍生的对应物更高的亲和性。甘露糖结合蛋白（MBP)也被称作甘露聚 糖结合蛋白、甘露糖-结合凝集素(MBL)、甘露聚糖-结合凝集素，或者杀菌Ra-反应因子。MBP 是属于一种可溶的Ca 2+依赖性(C型)凝集素家族的胶原凝集素。MBP通过(与补体激活的经典 途径和旁路途径不同的）凝集素途径作为补体激活物。补体系统是先天免疫防御的重要成 分，由如下三个途径激活:经典途径、旁路途径和最近揭示的凝集素或甘露糖结合凝集素 (MBL)途径。
[0023] 当催化结构域Clr和Cls通过识别蛋白Clq结合免疫复合物时，经典途径开始激活 (见图11)。
[0024] 旁路途径以抗体非依赖性方式低速持续进行(turning over)，攻击未针对补体而 被特异性保护的颗粒。
[0025]凝集素或MBL途径基于MBL与各种病原体或其它细胞结构上存在的碳水化合物结 构的结合而起始或激活。两种丝氨酸蛋白酶-甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶 (MASP)-I和_2(见图11)与MBL相关，显示出与丝氨酸蛋白酶Cls和Clr的显著相似性。所述复 合物基于与甘露聚糖的结合而具有C4和C3激活能力。所述复合物含有由二硫键连接的两种 丝氨酸蛋白酶MASP-I和MASP-2。在这种形式中，MASP能裂解C4和C3，导致其失活。与其血浆 衍生的对应物相比本发明的ClINH对于人MBP优选具有更高的亲和性。
[0026] MBP识别具有平伏的3-和4-OH基团的暴露的己糖，如甘露糖和N-乙酰葡糖胺和/或 N-乙酰-己糖胺。因此本发明优选的ClINH具有这种末端己糖。本发明ClINH比其没有暴露的 甘露糖和N-乙酰葡糖胺残基的天然血浆衍生的对应物对于MBP、优选人MBP的更高亲和性使 得可以更有效地靶向、结合和/或抑制MBP。人MBP在本文是指由Kawasaki et al.( 1983， J.Biochem 94:937-47)鉴定的蛋白质，具有Taylor et al.(1989，Biochem.J.262(3) ,763-771;NCBI登记号CAA34079)所述的氨基酸序列。与寡糖复合的大鼠MBP的结构由Weis et al. (1992,Nature·360:127-34)描述。关于人MBP的进一步描述见例如US 6,846,649及其中 引用的参考文献所述。
[0027] 所有这些途径(经典途径、旁路途径和凝集素或MBL途径）均产生至关重要的酶活 性，最后导致膜攻击复合物(MAC或C5b-C9)的装配(见图11)。在生理学条件下，补体系统的 激活由可溶的和膜结合的调节蛋白的协同作用而有效控制。这些蛋白质之一是Cl抑制剂 (ClINH)，这是结合Cls和Clr的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，是目前唯一已知的经典途径的生 理学抑制剂。另外，ClINH通过结合并抑制MASP-I和MASP-2而失活MBL-介导的补体活化。 [0028] 不同补体途径的激活优选在人血清中通过Wielisa试剂盒（产品no.COMPL 300， Wieslab，Sweeden)测量。这是一种可商购的酶免疫测定，利用C5b_C9的沉积作为常规读数 (common read-out)而特异性检测三种补体途径的每一途径。简而言之，将微滴定条的孔用 三种补体途径的每一途径的特异性激活物包被。人血清在含有特异性封闭剂的稀释剂中稀 释，以保证仅激活各自的途径。进一步加入浓度在0_75μπι 〇1范围内的本发明的ClINH或其血 浆衍生的对应物，在室温保温30分钟，加入所述孔中。在随后所述稀释的人血清在所述孔中 于37°C保温60分钟期间，补体通过特异性包被而被激活。然后洗涤所述孔，形成的C5b-C9用 特异性碱性磷酸酶标记的抗C5b-C9抗体检测。在进一步洗涤后，通过与碱性磷酸酶底物溶 液保温对特异性抗体进行检测。使补体激活量与色强度相关，并作为吸光度测量(光密度 0D)。使用这种试剂盒，发现本发明的重组人ClINH(rhCHNH)及血浆衍生的ClINH(pdCHNH)对 于经典途径具有相似的抑制能力。然而，发现本发明的CIINH比血浆衍生的Cl INH对于MBL途 径的抑制能力高大约20% (见实施例3)。
[0029]因此，在这个优选的实施方案中，用于本发明中ClINH的不同糖基化导致对于MBP 具有比其血浆衍生的对应物更高的亲和性，这导致对MBP更有效的抑制，使得可以更有效抑 制凝集素途径。对凝集素途径的更有效抑制优选是指至少高5%的抑制、还更优选至少高 10 %的抑制、还更优选至少高15 %的抑制、还更优选至少高20 %的抑制、还更优选至少高 25 %的抑制、还更优选至少高30 %的抑制、还更优选至少高35 %的抑制、还更优选至少高 40 %的抑制、还更优选至少高45 %的抑制、还更优选至少高50 %的抑制、还更优选至少高 55 %的抑制、还更优选至少高60 %的抑制、还更优选至少高65 %的抑制、还更优选至少高 70 %的抑制、还更优选至少高75 %的抑制、还更优选至少高80 %的抑制、还更优选至少高 85%的抑制、还更优选至少高90%的抑制、还更优选至少高95%的抑制及最优选至少高 98%的抑制。凝集素途径的活化优选通过上述Wielisa试剂盒测量。
[0030]本发明的方法可用于预防、降低或治疗任何类型的缺血和再灌注损伤。优选地，本 发明的方法应用于其中缺血和再灌注损伤已知至少部分通过、更优选主要通过凝集素途径 而产生的情况中。对于心肌缺血和再灌注损伤（J Immunology 2005,175:541-546)、肾缺 血-再灌注损伤（Am J Pathol .2004165(5) : 1677-88)、胃肠道缺血-再灌注损伤（J Immunol .200515:174(10) :6373-80)及中风（deSimoni et al,2004 Am J.Pathol. 164: 1857-63)，已经示出再灌注损伤主要是通过凝集素途径产生，很少通过经典途径产生。因 此，本发明的ClINH优选是比其天然血浆衍生的对应物更强的凝集素途径抑制剂。优选本发 明的ClINH在人体内是比其天然血浆衍生的对应物更强的凝集素途径的抑制剂。
[0031] 与本发明实施例中使用的实验模型不同，现实生活中缺血的发生通常是无法预见 的事件。因此在缺血和/或随后的再灌注发生之前给予ClINH通常是不现实的，在现实中 ClINH将不得不在缺血和/或随后的再灌注之后几个小时给予。然而，这严重限制了常规血 浆衍生的ClINH的治疗功效，因为当在缺血-再灌注之后给予时其大部分失效，并且仅具有 极小的治疗功效时间窗（见图2及deSimoni et al, 2004 Am J.Pathol .164:1857-63所述）。 相反，当也在缺血或者在缺血发作之后至少1小时和/或在开始再灌注之后30分钟注射本发 明的C1INH，其仍能发挥其神经保护作用。因此，在本发明的用于预防、降低或治疗至少一种 无法预见的或预见的缺血和再灌注损伤发生的方法的一个优选实施方案中，本发明的 ClINH至少在缺血结束或之后（即当缺血的组织被再灌注时）给予。更优选地，本发明的 ClINH在缺血之后或者在开始再灌注之后至少10、15、20、30、45、60、90或120分钟给予。优选 地，本发明ClINH在缺血之后或者在缺血和/或再灌注发生之后不超过24、12、6、4或3小时时 间内给予。在另一个优选的实施方案中，Cl抑制剂在缺血之后或者在缺血和/或再灌注发生 之后至少3小时、优选至少6小时、更优选至少9小时、更优选至少18小时给予。
[0032] 在一个优选的实施方案中，所述方法用于预防、降低或治疗无法预见的、突然的或 者急性发生的缺血-再灌注。与无法预见的、突然的或者急性发生的缺血-再灌注损伤相关 的病变或疾病包括但非限于在急性心肌梗塞(AMI)、中风包括围产期中风、失血性休克、肠 缺血、经皮冠状动脉腔内成形术(PCTA)失败后的急诊冠状动脉手术、具有血管夹紧(blood vessel cross clamping)的任何血管手术(例如大动脉夹紧，引起骨豁肌缺血)或者在处理 胰管或胆管之后的胰腺炎处理(ERCP)之后的缺血-再灌注损伤。在这种情况中，本发明的 ClINH优选在急性心肌梗塞(AMI)、中风包括围产期中风、失血性休克、肠缺血、经皮冠状动 脉腔内成形术(PCTA)失败后的急诊冠状动脉手术、具有血管夹紧的任何血管手术(例如大 动脉夹紧，引起骨骼肌缺血)或者在处理胰管或胆管之后的胰腺炎处理(ERCP)之后至少1、 5、10、15、20、30、45、60、90或120分钟给予。或者，给予本发明ClINH的时间优选在开始再灌