小鼠）。*卩〈 0 · 05，**P〈0 · 01，相对于盐水，单向ANOVA和Dunnett作为post-hoc检验。
[0076] 里也:在缺血发生后3小时接受盐水或每只小鼠15U pdCl-INH或者牛或兔rhCl-INH的小鼠在缺血48小时后评价的总体神经功能缺损(上方10a)和局灶性神经功能缺损（下 方10b)(每组6只小鼠）。*扑〈0.01，相对于盐水，单向ANOVA和Kruskal-Wallis作为post-hoc 检验。
[0077] Sn:补体激活的不同途径概述。
[0078] 图12、13 :rhCl INH和PdCl INH对经典补体途径激活的作用。向正常人血清的两个不 同样品（上方是样品1，下方是样品2)中加入增加剂量的rhClINH或pdClINH(x-轴）。作为对 照，利用其中溶解有与rhClINH同样稀释的rhClINH的缓冲液(20mM柠檬酸盐，0.19M蔗糖pH 6.8;经0.22μηι滤膜过滤）。读数为C5b_9的沉积，测定中正常血清对照规定为100 % (y-轴）。 数据以平均值和SD表示(η = 3)。
[0079] 图14、15: rhCl INH和pdCl INH对MBL补体途径激活的作用。向正常人血清的两个不 同样品（上方是样品1，下方是样品2)中加入增加剂量的rhClINH或pdClINH(x-轴）。作为对 照，利用其中溶解有与rhClINH同样稀释的rhClINH的缓冲液(20mM柠檬酸盐，0.19M蔗糖pH 6.8;经0.22μηι滤膜过滤）。读数为C5b_9的沉积，该测定中正常血清对照规定为100% (y-轴）。数据以平均值和SD表示(n = 3)。
[0080] 图16 :rhCl INH和pdCl INH对经典补体途径和MBL补体途径激活的作用。向正常人血 清的两个不同样品（上方是样品1，下方是样品2)中加入增加剂量的rhClINHSpdClIMKx-轴）。作为对照，利用其中溶解有与rhClINH同样稀释的rhClINH的缓冲液（20mM柠檬酸盐， 0.19M蔗糖pH6.8;经0.22μπι滤膜过滤），读数为C5b-9的沉积，每次测定的补体激活百分比以 下式计算：（样品-NCV(PC-NC) X 100 WC设为100%。结果以在每个测试浓度的3个独立 verdunning的平均值SD表示。 实施例
[0081 ] 实施例1
[0082]先前的实验示出在脑局灶性缺血小鼠模型中在缺血后48小时评价发现，在缺血开 始时给予单剂量rhClINH(15U/小鼠）以与血浆衍生的ClINH非常相似的方式显著降低缺血 体积。在这个实施例中，我们研究了rhClINH神经保护活性对于缺血体积和功能缺损的功效 时间窗。我们还通过评价神经变性和神经胶质应答研究了 rhCl INH对于七天结果（se ven-days outcome)的作用。
[0083] 1.方法
[0084] 1.1一过性局灶脑缺血
[0085] 如先前所述通过大脑中动脉栓塞（MCAO)实现缺血（De Simoni et al，2003和 2004，见上文）。通过在N20/〇2 (70/30 % )混合物中的5 %异氟醚诱导麻醉，用在相同混合物中 的1.5-2%异氟醚维持。为了证实每只动物中血管闭塞的合适度，使用激光多普勒血流仪 (Transonic BLF-21)利用位于脑表面上并用印模材料固定在颜骨上的柔软的0.5mm光纤探 头(Transonic,Type M，0.5mm直径）测量血流，坐标为AP = -Imm，L =-3，5_。简而言之，暴露 右颈总动脉，通过在颈总动脉上做的切口将硅丝（7-0)导入颈内动脉中并行进至大脑前动 脉，以阻断其分支进入大脑前动脉和MCA。使所述硅丝行进直至观测到与缺血前基线相比血 流减少>70%。在缺血30分钟后，小心除去所述尼龙丝恢复血流。
[0086] 1.2药物治疗
[0087] 在缺血后不同时间经静脉内单次注射给予小鼠150μ1的15U/小鼠rhCl INH或者相 同体积的盐水：
[0088] 一在缺血期开始时(rhClINH-前），
[0089] -在缺血期结束时(rhClINH-后），
[0090] 一在缺血期开始后1小时(rhClINH Ih-后）。
[0091] 这项研究中使用的rhClINH是在乳腺中表达人ClINH的转基因兔中产生，并从得自 这些动物的乳汁中纯化，如WO 01/57079所述。
[0092] 1.3神经功能缺损的评估
[0093] 在缺血48小时后，由有经验的未知实验条件的研究人员针对小鼠独特的两项神经 功能评分而对每只小鼠进行评估。总体神经功能缺损小鼠的如下类别的每一项得分为〇-28:毛发、耳、眼、姿势、自发活动、癫痫行为。局灶性神经功能缺损小鼠的如下类别的每一项 得分为0-28:身体对称性、步态、攀爬、旋转行为、前肢对称性、强制性旋转、感觉应答。数据 以中位值和第25至第75百分位值表示。
[0094] 1.4梗塞面积的量化
[0095] 在缺血48小时后，将小鼠用Equi tens in (120μ1/小鼠，腹膜内注射)深度麻醉，经心 灌注30ml的PBS 0.1mol/l、pH 7.4,随后灌注在PBS中的60ml冰冷多聚甲醛(4%)。在从颅腔 中小心取出脑之后，将其移至在PBS中的30 %蔗糖溶液中，在4°C低温保护过夜。然后将脑沉 浸在异戊烷中于_45°C速冻3分钟，之后密封于小瓶中，在-70°C贮存直至使用。为了确定损 伤面积，以240μηι间隔依次制作20μηι脑冠状切片，用中性红（Neutral Red Gurr Certi stain, BDH ,England)染色。在每个切片上，梗塞面积经盲式(blindly)评价并通过组 织学染色的相对苍白度(relative paleness)而描绘。梗塞面积通过从每个切片上的对侧 半球的面积中减去同侧半球中的正常组织面积而确定。通过使用计算机辅助图像分析仪并 通过图像分析系统(Analytical Image System)计算进行量化，综合每个脑组织切片上的 梗塞面积而计算梗死体积。
[0096] 1.5旷场试验(open field test)
[0097] 在缺血7天之后，通过旷场试验评估小鼠行为。这个试验可用于检测长期缺血小鼠 中的焦虑状态和探究行为及活动。旷场由一个包括4个不同物体的塑料箱组成（41x 41x 41cm)。旷场区域分成28x 28cm的中心带及周围的边缘带。将小鼠单独置于旷场的中心，由 未知实验条件的研究人员对小鼠的行为观测5分钟。记录inside crossings!；主要与焦虑行 为相关）、〇utside crossings!；主要与运动活性相关）、后腿站立(rears)(主要与探究行为 相关)及与物体接触(主要与感觉/运动活性相关)的次数。
[0098] 1.6神经元计数
[0099] 在缺血7天之后，如前所述对小鼠进行经心灌注。为了确定神经元计数，以640μπι间 隔依次切割成20μηι脑组织冠状切片，用甲酸紫(Cresyl Violet acetate ,Sigma, St .Louis, MO)染色。选择同侧和对侧半球的三个20μπι切片进行神经元计数测定。第一个切片是位于距 离前肉+0.86的前后方向立体定向坐标。神经元数量的减少通过集合两个半球的三个切片 中的存活神经元数而计算，以占对侧半球的百分比表示。使用连接有Soft Imaging System Colorview摄像机和AnalySIS软件的Olympus BX61显微镜。由未知处理情况的研究人员在 40 X放大率进行定量分析。
[0100] 1.7对星形胶质细胞和小胶质细胞进行免疫组织化学分析
[0101] 在缺血7天之后，制备厚度为20μπι的经心灌注的缺血小鼠脑组织的冠状截面切片， 用于评价星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞免疫染色。简而言之，将切片在含0.4% Triton X-IOO的O .lmol/L PBS溶液中漂洗30分钟，随后在含0.1 %Triton X-IOO和3%正常 山羊血清(NGS)的PBS溶液中漂洗15分钟。然后将切片与星形胶质细胞和小胶质细胞的抗体 (抗-GFAPl: 1500，Chemicon;抗-CDllb 1: 250,由Dr.A.Doni ,Mario Negri Institute惠赠） 保温过夜。第二天，将切片在I3BS中洗涤，与生物素酰化的二抗保温1小时，洗涤并与抗生物 素蛋白-生物素-过氧化物酶保温。在与3'-3_二氨基联苯胺四盐酸盐反应之后，洗涤切片， 干燥，通过梯度乙醇脱水，在二甲苯中固定，用DPX封固剂封盖，之后经光学显微镜分析。
[0102] 2.结果
[0103] 2.1功效的时间窗
[0104] 2.1.1神经功能缺损的评估
[0105] 在缺血48小时后接受rhClINH或盐水的缺血小鼠中评估神经功能缺损情况。观测 到与盐水处理的缺血小鼠相比，经rhCHNH-处理的每组小鼠均有轻微(尽管不显著）的降低 (^1(：11順-前：9和12 ;^1(：11順-后：7和11;^1(：11順111-后：9和13;盐水：10和12.5，分别为总 体和局灶性功能缺损的中位值)（数据未示出）。
[0106] 2.1.2梗死面积的评价
[0107] 在缺血48小时后，与盐水处理的小鼠（41.51 ±7. Olmm3)相比，剂量为151]/小鼠- 前、-后及Ih-后的rhCllNH-处理的小鼠示出缺血体积明显降低（缺血体积分别为13.67+ 2 · 59mm3、9 · 06+0 · 77mm3和8 · 24+1 · OOmm3)(图 1，数据以平均值土 SEM表示）。
[0108] 2.2七天结果
[0109] 2.2.1旷场实验
[0110]缺血诱导抬头次数较未试验过的动物显著减少，在rhClINH-处理组中这个参数与 未缺血的小鼠无差异。评估的其它参数在这三组中未示出任何差异。
[0111] 2.2.2神经元计数
[0112]为了评估rhClINH的保护作用是否长期存在，我们评价了在诱导缺血和用药物治 疗之后7天神经元的丧失情况。结果示出rhClINH保护作用在此时仍然存在：神经元丧失 14 % ± 2.18 %均值(盐水处理的小鼠）相对于4 % ± 1.24 %均值(rhCl INH处理的小鼠）（数据 未示出）。
[0113] 2.2.3对小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞进行免疫组织化学分析
[0114] 在缺血7天之后，在接受盐水的缺血小鼠的损伤的海马和纹状体中观测到大量激 活的小胶质细胞和浸润的巨噬细胞(数据未示出）。15单位的rhClINH-pre在这两个区域中 均能削弱这种激活和浸润作用(数据未示出）。经盐水处理的缺血小鼠的同侧海马示出轻微 的星形胶质细胞增生，这与在rhCHNH-处理的缺血小鼠中观测到的结果无差异（数据未示 出）。在任一组中的其它脑部区域未示出任何相关星形胶质细胞的激活。
[0115] 3.结论
[0116] 本发明数据示出剂量为15U/小鼠的rhCl INH当在缺血开始(-pre)或结束(-后，即 在再灌注时)给予对象时，在降低缺血体积方面作用相似。更重要的是当在缺血发生后1小 时（Ih-后)注射该抑制剂时其也能发挥神经保护作用。另外，rhClINH的保护作用在缺血后7 天仍存在。这些结果与血浆衍生的hClINH形成鲜明