Positivecontrol)。结果 可知对被TNF-a刺激增强的软骨基质分解酶（MMPl)产生的抑制能力，IgM型抗Fas抗体 (No. 7~8)比IgG型抗Fas抗体（No. 5~6)高。因此，IgM型抗Fas抗体可W说能够有效 果地抑制MMPl产生。
[0178] 图5B是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP3产生能力 的影响的图表。图5B的纵轴用每Iml培养基的浓度表示由软骨细胞产生的MMP3。图5B中，No. 1 表示阴性对照（Negativecontrol) ,No. 2 表示阳性对照（Positivecontrol)。结 果可知对被TNF-a刺激增强的软骨基质分解酶（MMP3)产生的抑制能力，IgM型抗Fas抗 体（No. 7~8)比IgG型抗Fas抗体（No. 5~6)高。因此，可W说IgM型抗Fas抗体能够 有效果地抑制MMP3产生。 阳179] 图5中显示IgM型抗Fas抗体有效果地抑制作为软骨基质分解酶的MMP的产生。 如上所述，MMP分解关节软骨。所W，MMP能够成为引起骨关节炎或使骨关节炎的症状恶化 的原因。如本实施例所示，IgM型抗Fas抗体抑制MMP的产生。由此IgM型抗Fas抗体能够 抑制骨关节炎发病，另外能够抑制骨关节炎的症状恶化。因此，IgM型抗Fas抗体能够优选 作为骨关节炎的预防剂使用。进而，因为MMPl及MMP3也参与免疫应答，所WIgM型抗化S 抗体也可W通过抑制MMPl及MMP3的产生用作骨关节炎的发病后引发的骨关节炎性关节炎 的预防剂或治疗剂。 阳180] 实施例6 W川 不同W巧的杭Fas杭体对淵亡的抑制效果
[0182] 使用ApoStandELISAApoptosisDetectionKit度iomolInternational社）研 究不同亚型的抗Fas抗体对被软骨异化诱导因子TNF-a诱导的软骨细胞的调亡是否有抑 制效果。
[0183] 与上述方法同样地使用2层式Transwell小室进行细胞培养。分别WIX1〇5 细胞/孔在化answell小室的下层接种软骨细胞，在上层中接种巨隧细胞。在上层中添 加TNF-a:Wng/ml。进而在上层中添加或未添加各种抗Fas抗体化OlnM)的条件下培 养48小时。除去培养基?诱导物质，加入试剂盒内的细胞固定液，将细胞固定。然后，将 溶液除去?干燥后，加入甲酯胺，在56°C下加热，使发生了调亡的细胞的DNA热变性。冷 却后，除去甲酯胺，加入封闭溶液度lockingsolution),进行封闭。除去封闭溶液，加入 抗single-strandedDNA(ssDNA)抗体在室溫下培养4小时。用PBS清洗3次后，加入 Peroxidasesubstrate,用微量滴定器测定405皿处的吸光度。将其结果示于图6。
[0184] 图6是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体的调亡抑制效果的图表。图6 的纵轴表示细胞的核的调亡的比例（％)。目P，值越低，越表示调亡被抑制。图6中，No. 1表 示阴性对照（Negativecontrol) ,No. 2表示阳性对照（Positivecontrol)。结果可知IgM 型抗Fas抗体与IgG型抗Fas抗体相比，能够抑制由TNF-a引起的软骨细胞的调亡。需要 说明的是，已知骨关节炎中是NF-Q被诱导的状态。因此，显示IgM型抗Fas抗体能够抑制 骨关节炎中引起的软骨细胞的调亡。 阳185] 图6中显示IgM型抗Fas抗体有效果地抑制由巨隧细胞导致的软骨细胞死亡。因 此，认为IgM型抗Fas抗体有效果地抑制软骨变性，能够优选用作骨关节炎的治疗剂或预防 剂。另外，认为上述作用是因为IgM型抗Fas抗体诱导了巨隧细胞的调亡。已知巨隧细胞 诱导炎症性细胞因子。因此，IgM型抗Fas抗体通过诱导巨隧细胞的调亡，抑制来自巨隧细 胞的炎症性细胞因子的释放，抑制炎症反应。因此，IgM型抗Fas抗体能用作对可由骨关节 炎引发的2次炎症反应（骨关节炎性关节炎）的预防剂及治疗剂。 阳186] 实施例7 。化7]IsM巧杭Fas杭体对骨关节《横巧大鼠的效果
[0188] 使用诱导了骨关节炎的大鼠进行IgM型抗Fas抗体CH-Il的药效评价试验。 。化W骨关节《横巧大鼠的制作
[0190] 将大鼠（Wisterrat,体重200g~250g)检疫?驯化饲养约1周后，进行盐酸氯 胺酬（PFIZER(株）社制，Ketalar100)及甲苯嚷嗦盐酸盐的并用麻醉（肌肉内给药），麻 醉效果差时在上述混合麻醉溶液或戊己比妥?化静脉内给药下除去左右膝关节部位的毛， 用作为舰类消毒液的聚締化酬舰消毒。消毒后，将膝关节内侧的表皮切开，切断内侧侧副初 带后，确认?切开关节包，将内侧半月板露出?全摘出。将关节包的周围组织及表皮缝合。 缝合时用包含抗生物质（注射用氨节青霉素钢）的生理盐水巧OOmg(效价）/20ml)清洗术 部。 阳191]制作的骨关节炎模型大鼠如下述表6所示分小组，使用27规格的注射针将受试物 质或对象液每周1次经24周进行关节内注射。
阳1巧]病理学檢杳
[0196] 每4周5只在戊己比妥?化（静脉内给药）的深麻醉下通过放血实施安乐死后进 行剖检。对于第8、12及24周的计划剖检例，采集左右膝关节组织、屯、脏、肺、肝脏、脾脏、肾 脏、脑、精巢及精囊，用4%对甲醒溶液固定。对于关节组织，将用Plank?Rychlo脱巧液脱 巧、进行中和后用石蜡包埋、切片得到的标本进行苏木素-伊红染色及番红0染色。对于其 他器官，将进行石蜡包埋、切片的标本进行苏木素-伊红染色，用光学显微镜实施病理组织 学检查。 阳197] IgM巧杭Fas杭体给药对关节搞病理紀织评分的影响
[0198] 将制作的骨关节炎模型大鼠分成3组，使用micro-needle注射器，每周1次在对 照组（表3中A及B)的左膝关节注入盐水或对照抗体溶液（10.化g/ml) 50. 0y1，在CH-11 给药组（表3中C及D)的左膝关节注入CH-Il(低用量给药组：1.Ong/ml，高用量给药 组：10.化g/ml) 50. 0Ji1。各组W例数4(n= 4)进行。关节炎及关节症的病势（关节症病理 组织评分）在处置后第4周、第8周、第12周、第16周及第24周进行观察，通过Student'ST 法统计学比较2组间的差。两组均不处置右膝关节，比较观察关节炎的发病和进行的程度。 将其结果示于图7。需要说明的是，关节症病理组织评分使用上述表4所示的修正Mankin 评分。 阳199] 图7A表示番红O染色的结果。图7B表示软骨细胞缺损的结果。图7C表示软骨结 构的结果。图7A~图7C的纵轴表示各评分，横轴表示经时变化。图7A~图7C的结果确 认了对照组的大鼠膝关节的软骨变性度（修正Mankin评分）与评分的各项目（表4:A~ C)均观察到经时增强，确认了关节症的诱导和增恶（骨关节炎从初期阶段移行到发展期阶 段）。相反，CH-Il给药组的评分有从给药开始后第8周开始显示比对照组的平均评分低的 值的倾向，在第12周W后CH-Il低用量给药组、CH-Il高用量给药组均观察到统计学显著 性差异。因此，IgM型抗Fas抗体CH-Il在初期~发展期阶段的骨关节炎模型大鼠中，显示 抑制软骨变性。因此，显示IgM型抗Fas抗体能够有效果地用于伴随软骨变性的分类为骨 关节炎的初期阶段~发展期阶段的疾病的治疗。 阳200] 实施例8 阳20。 IgM巧杭Fas杭体给药对病理紀织的影响 阳202] 通过上述病理组织学检查研究对骨关节炎模型大鼠给予IgM型抗Fas抗体时对各 组织的影响。骨关节炎模型大鼠使用处置后第12周及第24周的大鼠。用光学显微镜观 察?拍摄各大鼠的膝关节组织的病理标本的结果示于图8及图9。在图8及图9中，"X40" 及"X200"表示光学显微镜的倍率。 阳203] 图8是代表处置后第12周的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本的图的照 片。图8A~图8F表示对照的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图8G~图8J表 示CH-Il低用量给药组（CH-11:1.Ong/ml给药）的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标 本。图8K~图8N表示CH-Il高用量给药组（CH-ll:10.0ng/ml给药）的骨关节炎模型大鼠 的膝关节组织病理标本。图80表示对照的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图 8P表示CH-Il低用量给药组（CH-11:1.Ong/ml给药）的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病 理标本。图8B、图8D、图8F、图8G、图81、图8K及图8M分别表示代替图8A、图8C、图8E、图 細、图8J、图化及图8N中被四角包围的部分的放大图的照片。
[0204] 由图8的结果，在对照组（图8A~图8F及图80)中，与CH-11给药组（图8G~ 图8N及图8巧相比，确认了软骨变性（软骨细胞聚集或软骨细胞消失）。需要说明的是，软 骨细胞聚集可W由被番红0染色部位增加判断。软骨细胞消失如图80及图8P所示，可W 由番红O(SO)的染色性下降判断。该结果显示，因为通过给予CH-Il能够抑制软骨变性，所 WCH-Il能够治疗或预防伴随软骨变性的骨关节炎。 阳205] 图9是代表处置后第24周的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本的图的照 片。图9A~图9H表示对照的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标本。图91~图化表 示CH-Il低用量给药组（CH-11:1.Ong/ml给药）的骨关节炎模型大鼠的膝关节组织病理标 本。图9M~图9P表示CH-Il高用量给药组（CH-11:10.Ong/ml给药）的骨关节炎模型大 鼠的膝关节组织病理标本。图9B、图9D、图9F、图9H、图91、图9K、图9M及图90分别为在 图9A、图9C、图9E、图9G、图9J、图9L、图9N及图9P中被四角包围的部分的放大图的照片。 阳206] 由图9的结果，对照组（图9A~图9H)与CH-11给药组（图91~图9巧相比，确 认了软骨变性（软骨细胞消失或软骨基质结构变性）。由此显示因为通过给予CH-Il能够 抑制软骨变性，所WCH-Il能够治疗或预防伴随软骨变性的分类为骨关节炎的初期阶段到 发展期阶段的疾病。 阳207] 进而，本骨关节炎模型大鼠的CH-Il关节内给药组与对照大鼠组相比，观察到二 次性滑膜炎（炎症）W及软骨变性被有显著性差异地抑制。进而，CH-Il的关节内给药组在 试验后期基本没有观察到对照大鼠中观察到的骨增殖性变化（骨刺）。需要说明的是，对于 膝关节W外的脏器（屯、脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、脑、精巢及精囊），特别是在对照组和CH-Il 给药组之间观察到组织学差异。因此，作为IgM型抗Fas抗体的CH-Il显然能够特异性地 抑制动物中分类为骨关节炎的初期阶段~发展期阶段的疾病。 阳20引产业上的可利用性
[0209] 本发明的治疗剂或预防剂能够用于医药产业。
【主权项】
1. IgM型抗Fas抗体在制备用于治疗或预防骨关节炎的ICRS分类中分类为等级1~3 中的任一等级的疾病的治疗剂或预防剂中的应用，其中，IgM型抗Fas抗体通过抑制软骨的 破坏和促进软骨基质的产生发生作用。2. 如权利要求1所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是抗Fas抗原的细胞外结构 域的IgM型抗Fas抗体。3. 如权利要求1所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体为CHl1或7C11。 4. IgM型抗Fas抗体在制备用于治疗或预防骨关节炎的Kellgren-Lawrence分类中分 类为等级1~3中的任一等级的疾病的治疗剂或预防剂中的应用，其中，IgM型抗Fas抗体 通过抑制软骨的破坏和促进软骨基质的产生发生作用。5. 如权利要求4所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体为抗Fas抗原的细胞外结构 域的IgM型抗Fas抗体。6. 如权利要求4所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是CHl1或7C11。 7. IgM型抗Fas抗体在制备用于治疗或预防骨关节炎的Outerbridge分类中分类为等 级1~3中的任一等级的疾病的治疗剂或预防剂中的应用，其中，IgM型抗Fas抗体通过抑 制软骨的破坏和促进软骨基质的产生发生作用。8. 如权利要求7所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是抗Fas抗原的细胞外结构 域的IgM型抗Fas抗体。9. 如权利要求7所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是CHl1或7C11。 10. IgM型抗Fas抗体在制备软骨破坏抑制剂中的应用。11. 如权利要求10所述的应用，所述软骨破坏抑制剂用于治疗或预防骨关节炎的ICRS 分类中分类为等级1~3中的任一等级的疾病。12. 如权利要求10所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是抗Fas抗原的细胞外结 构域的IgM型抗Fas抗体。13. 如权利要求10所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是CHll或7C11。 14. IgM型抗Fas抗体在制备骨关节炎性关节炎治疗剂或预防剂中的应用。15. 如权利要求14所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是抗Fas抗原的细胞外结 构域的IgM型抗Fas抗体。16. 如权利要求14所述的应用，其中，上述IgM型抗Fas抗体是CHll或7C11。
【专利摘要】本发明的目的在于提供对骨关节炎及骨关节炎性关节炎(滑膜炎)的治疗剂及预防剂。本发明基于通过使用IgM型抗Fas抗体能够缓和骨关节炎的症状的认知。具体而言，本发明基于通过使用IgM型抗Fas抗体能够抑制软骨基质分解酶产生的认知。另外，本发明基于通过使用IgM型抗Fas抗体能够改善软骨基质产生能力。
【IPC分类】A61K39/395, A61P19/02
【公开号】CN105169389
【申请号】
【发明人】西冈久寿树, 游道和雄
【申请人】阿克西斯股份有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2009年7月31日