式存在。IgA型抗体的2聚体或3聚体通过J链或分泌片 (secretorypiece)结合。IgG型抗体W单体形式存在。作为本发明的抗Fas抗体，可W使 用上述各类型的抗体。另外，如上所述，Fas介入性调亡通过3聚体的Fas配体与Fas抗原 结合，促进Fas抗原的细胞内结构域的3聚体化，传递调亡信号。如上所述，因为IgM型抗 体形成聚合结构巧聚体或6聚体），所WIgM型抗体与3个W上的Fas抗原结合。由此使 得Fas抗原的3聚体化有效率地发生，传递调亡信号。因此，从该观点考虑，作为本发明中 的抗Fas抗体，优选使用IgM型抗体。
[0082] [多克隆抗体]
[0083] W下列举多克隆抗体的制造方法例，但本领域技术人员可W使用公知方法适当变 更。多克隆抗体可W通过在上述免疫动物中注入抗原（免疫原）进行制作。作为注入免疫 动物的抗原（免疫原），可W使用抗原表达细胞、（粗）精制蛋白质、重组蛋白质或合成肤 等。作为该抗原，可W举出由与上述序列编号1中记载的氨基酸序列相同或取代、缺失、附 加或插入了 1~10个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肤。如上所述，本发明的抗Fas抗体 是诱导Fas介入调亡的抗体，所W抗原优选为由与序列编号1的第26~173位的氨基酸序 列相同或取代、缺失、附加或插入了 1~5个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肤，在上述氨 基酸序列中被取代、缺失、附加或插入的氨基酸残基数更优选为1~2个，进一步优选为1 个。另外，因为本发明的抗Fas抗体是与Fas抗原结合，诱导Fas介入性调亡的抗体，所W 制造抗体时使用的肤（抗原）可W使用比由序列编号1的第26~173位的氨基酸序列构 成的肤短的肤。肤的长度只要是本领域技术人员就能适当调整。
[0084] 制造多克隆抗体时，抗原与佐剂混合，注入免疫动物。此处，佐剂是指为了强化对 抗原的免疫应答的目的而使用的物质，例如为侣佐剂、弗氏完全（不完全）佐剂、百日咳菌 佐剂等。对免疫动物注入抗原每2~4周进行一次。注入2次W上后，在注入日后1~2周 后进行采血，检查抗体效价（antibodytitercheck)。对免疫动物的注入量、注入次数（免 疫次数）根据每个免疫动物的种类或其个体而不同。如果是本领域技术人员，则可W对应 于抗体效价检查结果进行适当调整。免疫结束后，取全血，使用离屯、分离等公知方法，分离 血清。为了除去血清中包含的内源性抗体等而进行血清精制。精制方法可W使用例如亲和 色谱等公知方法。由此能够制作多克隆抗体。 阳O化][抗原表达细胞]
[0086] 作为抗原使用的抗原表达细胞优选在培养细胞等的细胞膜上表达了成为抗原的 蛋白质的细胞。上述抗原表达细胞可W通过公知方法制备。具体地，只要将编码作为抗原 的蛋白质的DNA导入培养细胞内使其表达即可。使抗原表达的培养细胞（W下也称为"宿 主"）没有特别限定，只要使用公知细胞即可。例如可W举出作为抗原递呈细胞已知的B细 胞或树状细胞等。作为使上述细胞表达作为抗原的蛋白质的方法，制备导入了编码作为抗 原的蛋白质的DNA的抗原表达载体，导入使抗原表达的细胞。导入表达载体中的DNA不包 含细胞膜结构域序列时，优选使其预先包含导入表达载体的宿主具有的细胞膜结构域的序 列。通过包含该序列，能够有效率地在细胞膜上表达蛋白质（抗原）。上述细胞膜结构域序 列只要是本领域技术人员就能够适当取得，将其包含在接入表达载体内的DNA序列中。作 为上述表达载体，可W使用含有启动子、增强子、剪接信号、ployA加尾信号、选择标记物、 SV40复制起点等的表达载体。宿主为动物细胞时，作为启动子，例如可W举出SRa启动子、 SV40启动子、HIV?LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子等。作为选择标记物，例如可W 举出二氨叶酸还原酶基因（甲氨蝶岭（MT讶抗性）、氨节青霉素抗性基因、新霉素抗性基因 (G418抗性）、潮霉素B(HygromycinB)抗性基因、灭攝素抗性基因等。上述表达载体只要 使用公知表达载体即可，只要是本领域技术人员，就能够对应于宿主进行适当选择。作为导 入抗原表达载体的方法，可W使用憐酸巧法、脂质转染法、电穿孔法等公知方法。作为确认 细胞中表达抗原的方法只要适当使用免疫染色法等公知方法即可。由此使抗原表达的细胞 可W通过公知方法回收，作为注入免疫动物的抗原使用。
[0087] [(粗）精制蛋白质]
[0088] 作为抗原使用的（粗）精制蛋白质是培养细胞等表达的蛋白质的精制品。上述蛋 白质只要通过作用于细胞的信号级联放大通路或作用于转录因子的药剂或因子刺激培养 细胞等使其表达即可。表达的蛋白质可W通过公知方法精制，作为精制蛋白质使用。例如 为分泌蛋白质，则可W回收培养上清，例如通过盐析或柱色谱、膜处理等进行精制。作为柱 色谱，可W举出离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、疏水性色谱等，只要是本领域技术 人员，就可W对应于蛋白质的性质适当使用。如果是没有分泌到细胞外的蛋白质，则可W回 收培养细胞，通过超声波处理等破碎细胞，回收蛋白质。然后只要通过上述方法精制蛋白质 即可。上述取得精制蛋白质的方法是公知的，只要是本领域技术人员，就能够对应蛋白质特 性适当使用。
[0089] [重组蛋白质]
[0090] 作为抗原使用的重组蛋白质可W通过公知方法制作。具体地将编码用作抗原的重 组蛋白质的DNA通过公知方法插入载体，导入使重组蛋白质表达的宿主。载体只要使用公 知载体即可，只要是本领域技术人员，就可W对应于导入的宿主进行选择。作为上述宿主， 可W使用细菌、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞等公知宿主。在宿主内导入载体的方法可W 是电穿孔法、憐酸巧法、脂质转染法等，对应于宿主适当使用公知方法。重组蛋白质可W是 651'(邑1111曰1：11；[0]18付曰]13'6阿36)，齡化61]1曰邑邑1111：；[]1；[]1)或（寡聚）组氨酸等与标签融合的 蛋白质。上述标签只要与编码作为目标的抗原的DM的N末端或C末端结合即可。通过结 合上述标签的融合蛋白质，能够简单地精制表达的蛋白质。在宿主中表达的蛋白质例如为 分泌蛋白质，可W通过回收培养上清进行回收，如果是非分泌蛋白质，则可W通过超声波处 理等破碎宿主细胞等进行回收。蛋白质的精制方法如上所述例如可W使用HPLC或亲和色 谱等。另外，也可W使用体外的蛋白表达体系或昆虫、动物、植物等生物体得到重组蛋白质。 上述方法是公知的，只要是本领域技术人员，就可W适当变更。
[00川[合成肤]
[0092] 作为合成肤的方法，可W举出固相法或液相法等。肤合成中，可W举出将作为目标 的氨基酸序列从N末端或C末端开始逐次结合的阶梯式延长法或将氨基酸序列分成适当的 片段，使上述片段缩合，合成目标肤的片段缩合法。另外，作为肤合成法，可W举出在不溶性 树脂上结合氨基酸，基于氨基酸序列信息，在该树脂上一个一个地结合氨基酸，使链延长的 固相法；不使用树脂等载体的液相法。进而，也可W组合上述方法有效率地合成。上述方法 是公知的，只要是本领域技术人员，就可W为了合成目标氨基酸序列而适当使用。另外，合 成的肤可W进行精制。合成肤的精制可W使用沉淀法、HPLC、离子交换色谱、凝胶过滤色谱 等公知方法。作为抗原使用合成肤时，因为原状态下缺乏抗原性，所W可W使用交联剂（例 如，MBS(m-maleimidobenxoicacid)醋，DMS(dimeth}dsuberimidate)等）使其共价结合 在BSA度ovineSerumA化umin)或KLH化eyholeLimpetHemo巧anin)等载体上进行使用。 阳〇9引[单克隆抗体]
[0094] 单克隆抗体可W通过公知方法制造。具体地可W间隔2~4周在1~6个月期间 将上述抗原注入（免疫）免疫动物（例如小鼠等），与多克隆抗体的制造方法同样地进行抗 体效价检查。一旦检查得到所希望的抗体效价，就从免疫动物分离脾脏。分离的脾脏悬浮 在无血清培养基（例如Iscove's培养基（GIBC0社制））中，制成脾脏细胞悬浮液。将脾脏 细胞和骨髓瘤细胞（骨髓瘤细胞）混合，加入聚乙二醇（PEG),使细胞融合。然后，通过用次 黄嚷岭化ypoxanthine)-氨基噪岭（aminopterine)-胸巧（thymidine) (HAT)选择培养基 培养，仅使杂交瘤细胞（脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合的细胞）增殖。进而，为了选择产生作 为目标的抗体的杂交瘤细胞，在检查有无作为目标的抗体的同时，进行检查阳性杂交瘤细 胞的克隆。通过多次重复该操作，能够得到产生作为目标的抗体的克隆化杂交瘤细胞。然 后，可W将克隆化杂交瘤细胞注射到免疫动物的腹腔内，2~4周后回收腹水，进行精制，由 此得到单克隆抗体。将腹水精制的方法只要使用公知的方法即可，例如可W举出亲和色谱 或凝胶过滤色谱等。
[00巧][重组抗体的制造方法]
[0096] 另外，本发明的抗体可W为重组抗体。重组抗体是指在抗体产生工序中没有使用 杂交瘤细胞的重组型单克隆抗体。作为例，可W举出仅具有最小的抗原结合部位的重组型 单克隆抗体、具有多价型的抗原结合部位的重组型单克隆抗体、组合IgG和IgA制成分泌型 的重组型单克隆抗体、实施了异种动物间的嵌合或人源化化umanization)的重组型单克 隆抗体等。上述重组抗体可W通过使各亚型的免疫球蛋白基因在宿主内表达而得到。作为 使用上述宿主的产生体系，可W举出使用大肠杆菌的方法、使用培养细胞的方法、使其在植 物中产生的方法、在转基因小鼠中产生的方法等。
[0097] 上述重组抗体的制造只要使用公知方法即可。作为具体例，可W举出隧菌体表面 展示技术系统（例女曰Ricombinantantibodyexpressionsystem(AmershamBiosciences) 等）。隧菌体表面展示技术系统是在作为大肠杆菌病毒的一种的M13等丝状隧菌体的外壳 蛋白质上不丧失隧菌体的感染能力地使外来基因作为融合蛋白表达的系统。隧菌体是指感 染细菌的病毒，具有在该DNA内接入外源性基因后感染并侵入宿主内进行增殖的能力。
[0098] [隧菌体表面展示技术系统]
[0099] W下列举通过隧菌体表面展示技术系统制作单克隆抗体的方法之一例，但本发明 并不限定于W下的利记博彩app，本领域技术人员可W使用其他公知方法适当变更各工序。另 夕F，只要是本领域技术人员，就可W在各工序中，适当设定溫度、反应时间、使用溶液浓度、 使用溶液量等参数，并加入变更进行实施。隧菌体表面展示技术系统中，首先制作隧菌体抗 体文库，然后筛选抗体产生隧菌体，由此制作单克隆抗体。 woo] 制作臉荫体杭体专库
[0101] (1)从B细胞中提取mRNA，进行RT-PCR，制作CDNA文库。 阳102] B细胞只要使用由小鼠或人等采集的细胞即可。B细胞的RNA提取例如可W使用 AGPC法（Acid-Guanidinium-Pheno^L-Qiloroform法）等。AGPC法中，首先在B细胞中加入 异硫氯酸脈溶液，进行匀浆。然后，在细胞的匀浆溶液中加入乙酸钢、苯酪、氯仿，进行混合， 进行离屯、。离屯、后，回收溶液的水层。在回收的水层中加入异丙醇，混合后，进行离屯、，使RNA 沉淀。沉淀物（RNA)再次溶解在异硫氯酸脈溶液中后，加入乙酸钢、苯酪、氯仿，进行振荡。 振荡后，进行离屯、，再回收水层。在回收的水层中再加入异丙醇，进行离屯、，使RNA沉淀。在 沉淀的RNA中加入70%乙醇，进行悬浮，再次离屯、，使RNA沉淀，由此能够得到总RNA(total RNA)。然后，由总RNA提取mRNA可W使用结合在存在于mRNA的C末端侧的聚A序列上的引 物（寡聚dT引物），通过PCR使mRNA扩增，用寡聚dT柱（例如QIAGEN社制）等提取?精 审Ij。另外，也可W通过使用覆盖了寡聚dT的磁珠（例如化calaiTesque社制）的亲和色 谱等进行提取和精制。精制的mRNA可W在包含逆转录酶的反应溶液中通过PCR制作CDNA 文库。 阳10引 似在L链（Li曲tchain)和H链化eavychain)的可变区域使用特异的引物分 别通过PCR进行扩增。
[0104] 作为抗体（免疫球蛋白（Ig)分子）的H链及L链的可变区域的Vh及Vl的序列可 W由例如GenBank等购入。例如为了得到IgA型的人抗体，只要购买人的IgA的\及VH序 列，进行用于增加上述序列的引物设计，作为模板使用上述cDNA，通过PCR使两序列扩增即 可。只要是本领域技术人员，就能够根据想要得到哪一种抗体，适当进行引物设计，另外也 可W适当确定PCR等的条件。扩增的\和VH只要通过公知方法精制即可。
[0105] 0)文库的构筑
[0106]精制的\和VH分别通过连接臂连接成为单链，插入隧菌体载体，构建单链Fv(可 变区域片段）基因文库。连接臂是连接各片段的序列。作为该连接臂，只要使用公知的序 列作为连接臂即可。隧菌体载体是指组合了M13隧菌体或n隧菌体的生成单链DNA所需 的复制起点（IG区域）的质粒载体。隧菌体载体具备作为质粒的特性和作为单链DNA隧 菌体的特性，不仅能够作为通常的双链DNA质粒进行操作，而且可W产生包含质粒中的一 条DNA链的线状隧菌体粒子。作为隧菌体载体，只要使用公知的隧菌体载体即可（例如 pCANTAB祀(AmershamBiosciences社制））。另外，作为其他方法，可W在抗体H链Fd部分 (Vh及CJ区域）及L链部分使用特异的引物，通过PCR扩增抗体基因片段，将上述基因片 段插入隧菌体载体，由此构建与抗体F油对应的基因文库。 阳107] 筛洗胃抗体产半騰荫化
[0108] (4)抗体表达隧菌体文库的浓缩
[0109] 将使用隧菌体载体构建的抗体基因文库导入大肠杆菌，使辅助隧菌体（M13K07， VCSM13等）感染，由此制作抗体表达隧菌体文库。作为该抗体表达隧菌体文库的浓缩方 法，可W举出盘选法（淘选，panning)。通过该方法