度环境）中进行培养。细胞的次代在用憐酸缓 冲液（PBS，NISSUI社制）清洗后，使用0. 25%膜蛋白酶-PBS液（Gibco社制）消化细胞， 通过移液使细胞分散后，用培养基稀释至适当的浓度。
[0137] 软骨细胸
[0138] 取得知情同意后，从骨关节炎患者的手术组织采集软骨组织，切碎后，在含有 1.5mg/ml胶原酶BkollagenaseB)的液体低葡萄糖Du化ecco'SmodifiedEagle's medium值MEM,Gibco社制）培养基内（37°C)下处理一夜，分离培养软骨细胞。通常，细 胞用培养烧瓶（培养面积25cm2)培养，实验中使用时在聚乙締制培养皿（直径6cm)中培 养。细胞培养使用在DMEM培养基中添加培养基容量的10%的灭活胎牛血清（FBS，TRACE社 制）、进而添加了 2mMk谷氨酷胺、25mM肥阳S、100units/ml的青霉素和链霉素的培养基， 在37°C、饱和湿度下，用设定为5 %C02+95 %air的C〇2培养器（正常氧浓度环境）进行培 养。细胞的次代在用憐酸缓冲液（PBS，NISSUI社制）清洗后，使用0. 25%膜蛋白酶-PBS液 (Gibco社制）消化细胞，通过移液使细胞分散后，用培养基稀释成适当的浓度。 阳139] 巨隧细胞
[0140] 取得知情同意后，从采集了上述手术检体的患者采血50ml，得到1%加肝素血。将 淋己细胞分离液上重叠了该血液的离屯、管W1500转/分离屯、30分钟，分别分离淋己细胞 和巨隧细胞。细胞培养使用在RPMI培养基中添加培养基容量的10%的灭活胎牛血清（FBS， TRACE社制）、进而添加了 2mMk谷氨酷胺、25mM肥阳S、100units/ml的青霉素和链霉素的 培养基，在37°C，饱和湿度下，用设定为5%C02+95%air的C〇2培养器（正常氧浓度环境） 进行培养。
[0141] 伸用2房式Transwell小牵的细胸培养 阳142] 在用3ym微孔尺寸的多孔过滤器隔开的2层式Transwell小室（东洋纺）的上 层部接种滑膜纤维芽细胞（1X1〇6个/孔）或巨隧细胞（1X10 6个/孔），在下层部接种软 骨细胞（lXl〇6个/孔），进行培养。该培养体系的上层（炎症性细胞培养层）相当于滑膜 炎，下层（软骨培养层）相当于软骨组织。在小室上层添加或未添加各种浓度（0.1，1.0， 10.Ong/ml)的IgM型抗Fas抗体的条件下，在上层添加炎症性细胞因子（TNF-a:l〇ng/ml 或比-Ie:lOng/ml)，培养48小时。经时回收培养上清和细胞，通过下述实验方法解析各种 细胞活性。 阳143] 实施例2
[0144] 研究IgM巧杭Fas杭体对软骨基质分解酶（MMP)产牛的抑制作用
[0145] 使用酶联免疫吸附法巧LISA)分析IgM型抗Fas抗体（CH-11 (小鼠抗体）（M化社 制））对通过软骨异化诱导因子TNF-a增强的软骨基质分解酶产生的影响。研究所使用 的IgM型抗Fas抗体（CH-11)是由将小鼠骨髓瘤细胞NS-I和Ba化/c小鼠的脾脏融合得到 的杂交瘤产生的抗体。杂交瘤由来自人2倍体纤维芽细胞株（Humandiploidfibroblast cellline)FS-7的抗原制作。 阳146] 分别WIXIO6个/孔将通过上述方法分离培养的软骨细胞接种到Transwell小室 的下层，将滑膜纤维芽细胞接种到上层。在上层中添加TNF-a:l〇ng/ml。进而按下述表1 的组合在上层中添加各种浓度化1，1. 0,5. 0,10.Ong/ml)的IgM型抗Fas抗体或透明质酸 制剂（HA)，培养48小时后，回收培养液。另外，作为比较对照，使用透明质酸制剂（HA) (0. 1， 1.0111旨/11^)。研究条件的组合示于下表5。表5中，1^-〇(+)的了^-〇浓度为10叫/1111。HA的浓度单位为mg/ml，IgM型抗Fas抗体CH-Il的浓度单位为ng/ml。表I的No.I为阴 性对照（Negativecontrol)，No. 2 为阳性对照（Positivecontrol)。
[0150] 培养上清中的软骨基质分解酶基质金属蛋白酶（MMP)-UMMP-3浓度使用作为本
技术领域目前已知的标准技术的化ISA试剂盒（MMP-1，MMP-3:R&D社制）确定。该化ISA通过W下的标准方法进行。ELISAW样本数6(n=6)进行。将稀释的培养上清样品按致 敏平板每1孔添加100y1，在室溫下静置1小时（1次反应）。1次反应后，使用清洗瓶， 将各孔用PBS充分清洗4次W上。将用0. 1%Tween20-PBS稀释了 3000倍的辣根?过氧 化物酶化orseradishPeroxidase=HRP)标记山羊抗兔IgG化+L)抗体，在各孔中每孔分注 100y1，在室溫下静置1小时（2次反应）。2次反应后，同样地用PBS清洗后，每1孔添加 IOOyl0.8mMTMB(四甲基联苯胺：Tetramethy化enzidine)溶液，在30°C下显色5~20 分钟（显色反应）。每1孔加入100y1 1. 5NH3PO4,使显色反应停止，使用微量滴定板读取 器（microtiterplatereader),测定450皿处的吸光度。根据制造商提供的说明书，使用 对照冷冻干燥试剂校正测定浓度，进行显著性差异检查。结果示于图2。图中，*表示显著 性差异检查的拒绝率（P值）不足0. 05 (P<0. 05)，**表示显著性差异检查的拒绝率（P值） 不足 0. 01(P<0. 01)(下同）。 阳151]图2A是代表IgM型抗Fas抗体对软骨细胞的MMPl产生能力的影响的图表。图2A的纵轴用每Iml培养基的浓度表示由软骨细胞产生的MMPl。结果可知对被TNF-a刺激 增强的软骨基质分解酶（MMPl)产生的抑制能力，IgM型抗Fas抗体（No.5~8)比HA单独 (No.3及4)高。因此，表示IgM型抗Fas抗体能够有效果地抑制MMPl产生。 阳152]图2B是代表IgM型抗Fas抗体对软骨细胞的MMP3产生能力的影响的图表。图2B的纵轴用每Iml培养基的浓度表示由软骨细胞产生的MMP3。结果，可知对被TNF- a刺激 增强的软骨基质分解酶（MMP3)产生的抑制能力，IgM型抗Fas抗体（No. 5~8)比HA单独 (No. 3及4)高。因此，表示IgM型抗Fas抗体能够有效果地抑制MMP3产生。 阳153]图2中显示IgM型抗Fas抗体有效果地抑制作为软骨基质分解酶的MMP的产生。 如上所述，MMP分解关节软骨。所W，MMP能成为引起骨关节炎或使骨关节炎的症状恶化的 原因。如本实施例所示，IgM型抗Fas抗体抑制MMP的产生。由此，IgM型抗Fas抗体能够 抑制骨关节炎发病，另外能够抑制骨关节炎的症状恶化。因此，IgM型抗Fas抗体能优选用 作骨关节炎的预防剂。进而，因为MMPl及MMP3也参与免疫应答，所W IgM型抗Fas抗体通 过抑制MMPl及MMP3的产生，也可W用作骨关节炎发病后发生的骨关节炎性关节炎的预防 剂或治疗剂。 阳154] 实施例3 阳1巧]IgM巧杭Fas杭体对软骨基质产牛能力下降的放善作用的研究
[0156] 使用化ISA解析IgM型抗Fas抗体对因软骨异化诱导因子TNF-a或]X-IP而下 降的软骨基质（蛋白聚糖）产生能力是否有抑制效果。
[0157] 与上述IgM型抗Fas抗体对软骨基质分解酶酸性的抑制作用的研究中使用的方 法同样地分别WIXIO6个/孔在Transwell小室的下层接种软骨细胞，在上层接种巨隧细 胞。在上层中添加TNF-a:l〇ng/ml或]X-10:lOng/ml。进而在上层中添加或未添加各种 浓度（1. 0,10.Ong/ml)的IgM型抗Fas抗体的条件下培养48小时后，回收培养液。培养上 清中的软骨基质（蛋白聚糖）产生量（浓度）使用作为本技术领域目前已知的标准性技术 的化ISA试剂盒（蛋白聚糖：Biosource社制）确定。将其结果示于图3。
[0158] 图3是代表IgM型抗Fas抗体对软骨基质（蛋白聚糖）产生能力下降的效果的图 表。图3的纵轴表示蛋白聚糖产生量。纵轴的值越高高，越产生蛋白聚糖。目P，表示IgM型 抗Fas抗体改善被TNF-a抑制的蛋白聚糖合成能力。结果可知IgM型抗Fas抗体能够改 善被TNF-a及IL-I0抑制的软骨基质（蛋白聚糖）合成能力。
[0159] 图3中显示IgM型抗Fas抗体改善软骨基质（蛋白聚糖）的合成。骨关节炎中， 作为病态观察到关节软骨的破坏。因此，因为IgM型抗Fas抗体能够改善骨关节炎中被破 坏的关节软骨再生所需的软骨基质（蛋白聚糖）的合成，所W能优选用作骨关节炎的治疗 剂。 阳16〇] 实施例4
[0161] IgM巧杭Fas杭体对淵亡的抑制效果
[0162] 使用ApoStandELISAApotosisDetectionKit度iomolInternational社）研 究IgM型抗Fas抗体对被软骨异化诱导因子TNF-a诱导的软骨细胞的调亡是否有抑制效 果。该试剂盒用甲酯胺使发生调亡的细胞的DNA特异性变性，通过抗single-strandedDNA 抗体检出变性的DNA，能够定量地检出调亡。
[0163] 与上述IgM型抗Fas抗体对软骨基质分解酶酸性的抑制作用的研究中使用的方 法同样地分别WIXlO6个/孔在Transwell小室的下层接种软骨细胞，在上层中接种巨 隧细胞。在上层中添加TNF-a:l〇ng/ml。进而在上层中添加或未添加IgM型抗Fas抗体 (10.Ong/ml)的条件下培养48小时。除去培养基?诱导物质，加入试剂盒中附带的细胞固 定液，固定细胞。然后，将溶液除去并干燥后，加入甲酯胺，在56°C下加热，使发生调亡的细 胞的DNA热变性。冷却后，除去甲酯胺，加入封闭溶液度lockingsolution),进行封闭。除 去封闭溶液，加入抗single-strandedDNA(ssDNA)抗体，在室溫下培养4小时。用PBS清 洗3次后，加入化roxidasesubstrate,用微量滴定器测定405皿处的吸光度。将其结果示 于图4。
[0164] 图4是代表IgM型抗Fas抗体的调亡抑制效果的图表。图4的纵轴表示细胞的核 的调亡的比例（％)。目P，值越低，表示调亡被抑制。结果可知IgM型抗Fas抗体能够抑制 由TNF-a引起的软骨细胞的调亡。需要说明的是，已知骨关节炎是TNF-a被诱导的状态。 因此，根据本实施例，表示IgM型抗Fas抗体能够抑制骨关节炎中引起的软骨细胞的调亡。 阳1化]图4中表示IgM型抗Fas抗体抑制巨隧细胞导致的软骨细胞死亡。因此，认为IgM型抗Fas抗体抑制软骨变性，能够优选用作骨关节炎的治疗剂或预防剂。另外，认为上述用 途是因为IgM型抗Fas抗体诱导了巨隧细胞的调亡。已知巨隧细胞诱导炎症性细胞因子。 因此，IgM型抗Fas抗体通过诱导巨隧细胞的调亡，抑制来自巨隧细胞的炎症性细胞因子的 释放，抑制炎症反应。因此，IgM型抗Fas抗体能用作对可由骨关节炎引发的2次炎症反应 (骨关节炎性关节炎）的预防剂及治疗剂。 阳166] 实施例5 阳167] 对于有调亡诱导能力的激动剂抗Fas抗体作为OA治疗药的可能性，在invitro 实验系中评价抗体的亚型（IgG型和IgM型）的差异产生的该可能性的差异。IgG型抗体使 用UB2 (MBL社制）及ZB4 (MBL社制）。IgM型抗体使用CH-Il(MBL社制）及7C11@eckman Coulter社制）。各自的对照使用IgG同种型（SouthernBiotech社制）及IgM同种型 (SouthernBiotech社制）。
[0168] 培养细胸的律立
[0169] 取得知情同意后，由骨关节炎患者5名（n= 5)的手术组织采集骨软骨组织和末 梢血，通过与实施例1同样的方法采集滑膜纤维芽细胞、软骨细胞及巨隧细胞。 阳170]伸用了 2房式Transwell小牵的细胸培养 阳171] 在被3mm微孔尺寸的多孔过滤器隔开的2层式反式孔小室（东洋纺社制）的上层 部接种滑膜纤维芽细胞（1X1〇5个/孔）或巨隧细胞（1X10 5个/孔），在下层部接种软骨 细胞（IX1〇5个/孔），进行培养。该培养体系的上层（炎症性细胞培养层）相当于滑膜炎， 下层（软骨培养层）相当于软骨组织。
[0172] 在小室上层内添加或未添加各种的上述Fas抗体或同种型的条件下，在上层中添 加炎症性细胞因子灯NF-a:lOng/ml)，培养48小时。经时回收培养上清和细胞，通过下述 实验方法解吸各种的细胞活性。 阳17引 不同W巧杭Fas杭体对软骨基质分解酶（MMP)产牛的抑制作用
[0174] 使用酶结合免疫分析法巧LISA)解析不同亚型抗Fas抗体对被软骨异化诱导因子 TNF-a增强的软骨基质分解酶产生的影响。
[01巧]分别W1XIO5细胞/孔将通过上述方法分离培养的软骨细胞接种到Transwel1小 室的下层，将滑膜纤维芽细胞接种到上层。在上层中添加TNF-Q:l〇ng/ml。进而在上层中 添加或未添加各种浓度化OlnM)的各种Fas抗体的条件下培养48小时后，回收培养液。 阳176] 培养上清中的软骨基质分解酶基质金属蛋白酶（MMP)-UMMP-3浓度使用作为本
技术领域目前已知的标准性技术的ELISA试剂盒（MMP-1，MMP-3 (R&D社制））确定。需要说 明的是，ELISA与上述方法同样地进行。将其结果示于图5。
[0177] 图5A是代表IgM型抗Fas抗体或IgG型抗Fas抗体对软骨细胞的MMPl产生能力 的影响的图表。图5A的纵轴用每Iml培养基的浓度表示由软骨细胞产生的MMP1。图5A中， No. 1 表不阴性对照（Negativecontrol)，No. 2 表不阳性对照（