钠、脱氢醋酸钠、丙酸钠、山梨酸、硫柳汞、thymo及 其混合物。
[0074] 合适的包衣添加剂包括，例如，羧甲基纤维素钠、醋酸邻苯二甲酸纤维素、乙基纤 维素、明胶、药用釉料膜（glaze)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻 苯二甲酸酯、甲基纤维素、聚乙二醇、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、紫胶、蔗糖、二氧化钛、巴 西棕榈錯、微晶錯及其混合物。合适的保护性的包衣剂包括Aquacoat(例如Aquacoat乙 基纤维素水分散体，15%w/w,FMCBiopolymer,ECD-30)，Eudragit(例如EudragitEP0 PE-EL,RoehmPharmaPolymers)和欧巴代（例如欧巴代AMB分散体，20%w/w,Colorcon)。
[0075] 在某些实施方案中，适用于利那洛肽组合物的添加剂包括蔗糖、滑石粉、硬脂酸 镁、交聚维酮或BHA中的一种或多种。
[0076] 在某些实施方案中，术语"95% "可以是95. 0%，术语"90% "可以是90. 0%，术语 " 10%"可以是10. 0%，术语"9%"可以是9.0%，术语"8%"可以是8.0%，术语"7%"可 以是7.0%，术语"6%"可以是6.0%，术语"5%"可以是5.0%，术语"4%"可以是4.0%， 术语"3%"可以是3.0%，术语"2%"可以是2.0%，且术语"1%"可以是1.0%。
[0077] 在某些实施方案中，所述利那洛肽组合物以单位剂型提供。在有些实施方案中，单 位剂型是胶囊、片剂、药囊、丸剂或散剂。在一个这样的实施方案中，单位剂型是胶囊剂或片 剂。这样的单位剂型可以被装在容器中，该容器例如，不限于，纸或卡纸盒、玻璃或塑料瓶或 罐、可重新密封的袋（例如，用于容纳片剂的"重填"，以放入不同的容器）、或泡罩包，所述 泡罩包含有单个剂量，用于根据治疗方案从该包压出。在单个包装中一起使用一个以上的 容器以提供单一剂型，也是可行的。例如，可以将片剂或胶囊装在瓶子中，所述瓶子又装在 盒子内。在有些实施方案中，将单位剂型在另外装有干燥剂的容器中提供。在进一步实施方 案中，将单位剂型（例如，一定量片剂或胶囊）提供在装有干燥剂的容器（例如，瓶子、罐或 可重新密封的袋）中。在进一步实施方案中，将装有单位剂型的容器与施用或剂量说明书 一起包装。在某些实施方案中，利那洛肽组合物提供在药剂盒中。可以将本文所述的利那 洛肽组合物和联合治疗剂包装为包括单个或多个剂量的2种或更多种药剂的药剂盒，它们 各自单独地包装或配制，或组合地包装或配制单个或多个剂量的2种或更多种药剂。因而， 利那洛肽组合物可以存在于第一个容器中，且药剂盒可以任选地包括在第二个容器中的一 种或多种药剂。一个或多个容器放在包装内，且所述包装可以任选地包括施用或剂量说明 书。
[0078] 实施例
[0079] 下面的实施例仅仅是本发明的例证，不应当解释为以任何方式限制本发明的范 围，因为本领域技术人员在阅读本公开内容后，会明白本发明包括的许多变化和等同方案。
[0080] 使用本领域已知的标准技术，例如，化学合成或重组表达，继之以使用标准技术的 纯化，可以生产和纯化利那洛肽或其药学上可接受的盐。
[0081] 制剂方案A
[0082]包衣溶液的制备：将大約32g至42g纯化水与盐酸混合，以产生pH在1. 5至2. 0 的溶液。将一定量的阳离子（如果使用的话）加入溶液，以提供希望的浓度，并将溶液混合 足够的时间，以生成澄清溶液。将一定量的空间阻碍的伯胺（如果使用的话）加入溶液，以 提供希望的浓度，并将溶液混合足够的时间，以生成澄清溶液。然后加入其它添加剂，诸如 抗氧化剂（如果需要的话）。测试溶液的pH，并在必要时加入盐酸，以生成pH在1. 5至2. 0 的溶液。然后将粘合剂加入溶液，并然后将混合物搅拌足够的时间，以生成澄清溶液。将希 望的量的利那洛肽加入溶液，并混合30-100分钟，以得到包衣溶液。
[0083]活性珠子的制备：将大约30_36g干燥的微晶纤维素珠子加入微型柱流化床包衣 机（MiniColumnFluidBedCoater)中。在包衣之前，使微晶纤维素珠子流态化，并加热。 接着，将包衣溶液包被到珠子上。通过控制入口温度、喷雾速率、雾化压力和空气体积，将喷 雾温度控制在24°C至55°C之间。在将所有包衣溶液包被到珠子上以后，干燥珠子。该过程 的产品称作活性珠子。
[0084] 具有保护性包衣的活性珠子的制备：将大约35g活性珠子加入微型柱流 化床包衣机。在用Aquacoat(例如Aquacoat乙基纤维素水分散体，15 %w/w,FMC Biopolymer，ECD-30)，Eudragit(例如EudragitEP0PE_EL，RoehmPharmaPolymers)和 欧巴代（例如欧巴代AMB分散体，20%w/w，Colorcon)包衣之前，使活性珠子流态化，并加 热。接着，将包衣溶液包被到珠子上。通过控制入口温度、喷雾速率、雾化压力和空气体积， 将喷雾温度控制在24°C至55°C之间。在将所有包衣溶液包被到珠子上以后，干燥珠子。
[0085] 制剂方案B
[0086]包衣溶液的制备：将大約8. 3kg纯化水与盐酸混合，以产生pH在1. 5至2. 0的溶 液。将一定量的阳离子（如果使用的话）加入溶液，以提供希望的浓度，并将溶液混合足够 的时间，以生成澄清溶液。将一定量的空间阻碍的伯胺（如果使用的话）加入溶液，以提供 希望的浓度，并将溶液混合足够的时间，以生成澄清溶液。然后加入其它添加剂，诸如抗氧 化剂（如果需要的话）。然后将粘合剂加入溶液，并将溶液混合足够的时间，以生成澄清溶 液。测试溶液的pH，并在必要时加入盐酸，以生成pH在1. 5至2. 0的溶液。这是溶液1。将 大约8. 3kg纯化水与盐酸混合，以产生pH在1. 5至2. 0的溶液。将希望的量的利那洛肽加 入溶液，并混合10-30分钟。测试溶液的pH，并在必要时加入盐酸，以生成pH在1. 5至2. 0 的溶液。这是溶液2。然后将溶液1和溶液2混合到一起。测试溶液的pH，并在必要时加 入盐酸，以生成pH在1. 5至2. 0的溶液。这是包衣溶液。
[0087]活件珠子的制备：将大約24. 19kg微晶纤维素珠子加入GlattGPCG-30流化床的 Wurster柱。使微晶纤维素珠子流态化，并加热到产品的温度45-47°C。接着，将包衣溶液 包被到珠子上。通过控制入口温度、喷雾速率、雾化压力和空气体积，将产物喷雾温度控制 在37°C至47°C。在将所有包衣溶液包被到珠子上以后，用37°C至47°C的产物干燥温度干 燥珠子。该过程的产品称作活性珠子。
[0088] 实施例1-15:利那洛肽制剂的制备
[0089] 基本上如制剂方案A所述，生产实施例1-15的利那洛肽制剂，其中表1提供了阳 离子、空间阻碍的伯胺、粘合剂、利那洛肽和珠子的量，而表2提供了包被珠子的条件：
[0090]表1
[0091]
[0092]
[0093] * "阳离子"表示在实施例中使用的盐包含的二价阳离子，"胺"表示空间阻碍的伯 胺，□表示阳离子和/或胺与利那洛肽的摩尔比。
[0094] **基于在为利那洛肽活性药物成分（API)的每个生产批次提供的分析证书上列 出的肽含量和色谱纯度，确定在该实施例和所有以下实施例中的利那洛肽的量。
[0095] 表 2
[0096]
[0097] 实施例16:利那洛肽制剂的制备
[0098] 基本上如制剂方案B所述，生产实施例16的利那洛肽制剂，其中表3提供了阳离 子、空间阻碍的伯胺、粘合剂、利那洛肽和珠子的量，而表4提供了包被珠子的条件：
[0099] 轰1
[0100]
[0103] 实施例17:利那洛肽制剂的制备
[0104] 除了制剂含有22. 96mg丁羟茴醚（BHA)以外，基本上如制剂方案A所述，生产实施 例17的利那洛肽制剂，其中表5提供了阳离子、空间阻碍的伯胺、粘合剂、利那洛肽和珠子 的量，而表6提供了涂覆珠子的条件。
[0105]表 5
[0106]
[0109] 实施例18:含有利那洛肽制剂的胶囊的制备
[0110] 如实施例21所述，或通过其它等效方法，可以测量活性珠子上的利那洛肽含量。
[0111] 为了形成适合口服给药的胶囊，使用适当量的活性珠子来填充明胶胶囊（例如， 2号明胶胶囊）。适当量的活性珠子可以含有50yg至2mg利那洛肽/胶囊，在±5%范 围内。在有些实施方案中，在活性珠子上的利那洛肽的适当量可以是50yg、67. 5yg、 100Ug、133ug、150ug、200ug、266ug、300ug、400ug、500ug、600ug、700ug、800ug、 900yg、lmg、2mg、4mg或6mg。在一个具体实施方案中，在活性珠子上的利那洛肽的适当量 是 67. 5yg、100yg、133yg、150yg、200yg、266yg、300yg、400yg、500yg、600yg。在一 个更具体的实施方案中，在活性珠子上的利那洛肽的适当量是每个胶囊67. 5yg、133yg、 150yg、266ygS300yg。
[0112] 在另一个实施方案中，将用于填充预期数目的明胶胶囊的适当量的活性珠子放在 容器中。如果需要，可以将一种或多种药学上可接受的填充剂或其它药学上可接受的添加 剂加入容器中。在有些实施方案中，填充剂或添加剂是滑石粉、亮氨酸、微晶纤维素或甘露 醇。混合容器的内容物，并使用混合物填充明胶胶囊，具有适当量的含有利那洛肽的活性珠 子（例如，每个胶囊50yg至2mg利那洛肽，在±5%范围内）。
[0113] 在一个替代实施方案中，使用适当量的活性珠子填充明胶胶囊，并将一种或多种 药学上可接受的填充剂或其它药学上可接受的添加剂加入明胶胶囊中。
[0114] 实施例19:含有利那洛肽制剂的胶囊的制备
[0115] 包衣溶液的制备：首先，将41. 98g纯化水与1. 13g盐酸相混合，以产生pH在1. 5 至2. 0的溶液。接着，将7. 49g氯化钙二水合物和6. 68g亮氨酸加入溶液中，然后将其混合 30分钟，以生成澄清溶液。测试pH，并加入1. 70g盐酸，以生成pH在1. 5至2. 0的溶液。接 着，将13. 27g轻丙甲纤维素（轻丙基甲基纤维素；DowChemicalCompany;Midland，MI)加 入溶液，并将混合物搅拌60分钟，以得到澄清溶液。接着，将4. 39g利那洛肽加入溶液，并 混合90分钟。溶液的pH是1.73。这是包衣溶液。
[0116] 活性珠子的制备：将674. 5g微晶纤维素珠子（CelphereCP-305;AshaiKasei Corporation(日本东京）加入GlattGPCG-2流化床的Wurster柱。使微晶纤维素珠子流 态化，并在60°C的产物温度加热30分钟。接着，将包衣溶液包被到珠子上。通过80°C的入 口温度、5. 0-llg/min的喷雾速率、2. 0巴的雾化压力和40-50m3h的空气体积，将产物温度 控制在45°C至49°C之间。在将所有包衣溶液包被到珠子上以后，用46. 9°C至50. 9°C的产 物温度干燥珠子10分钟。该过程的产品称作活性珠子。
[0117] 从如上所述制备的制剂提取的利那洛肽的反相液相色谱法证实，提取的利那洛肽 和利那洛肽参比标准表现出相同的保留时间，且所述制剂过程结果没有引起纯度的显著变 化。
[0118] 为了形成胶囊，将49. 50g活性珠子加入透明袋。接着，将筛过60目筛的0.25g亮 氨酸加入该袋。系紧袋子，并混合125转，从而混合所有物质。接着，将筛过60目筛的0. 25g 滑石粉加入该袋。系紧袋子，并混合125转，从而混合所有物质。一旦混合所有物质后，使 用混合物填充2号明胶胶囊，目标重量为227mg/胶囊，在±5%范围内。
[0119] 实施例20:含有利那洛肽制剂的胶囊的制备
[0120] 根据实施例16制备活性珠子。测试活性珠子的利那洛肽含量。基于活性珠子的测 定，使用MG2Futura封装机，将适当量的活性珠子（96mg- 123mg)填充进2号硬明胶胶囊， 以得到300yg的利那洛肽浓度。
[0121] 根据实施例15制备活性珠子。测试活性珠子的利那洛肽含量。基于活性珠子的 测定，使用MG2Futura封装机，将适当量的活性珠子（48mg- 62mg)填充进2号硬明胶胶囊， 以得到150yg的利那洛肽浓度。
[0122] 实施例21:利那洛肽含量和纯度的测量
[0123]使用具有ChemstationRevA. 09. 03 软件或等效软件的AgilentSeries1100LC 系统，通过反相梯度液相色谱法，可以测定利那洛肽含量和纯度，以及利那洛肽-相 关物质的测量。使用YMCPro?C18 柱（尺寸：3.Ox150mm，3. 5um，1 20A;Waters Corp.，Milford，MA)或等效柱，并维持在40°C。流动相A(MPA)由含有0. 1%三氟醋酸的水 组成，而流动相B(MPB)由95%乙腈：5%含有0.1%三氟醋酸的水组成。如下洗脱利那洛 肽和它的相关物质：使用在28分钟内的0%至47%MPB的梯度，继之以在4分钟内升高至 100%MPB，在100%MPB保持5分钟，以洗涤柱。通过在1分钟内恢复至0%MPB，继之以在 100%MPA保持10分钟，重新平衡柱。流速是0. 6mL/min，并用220nm紫外线进行检测。
[0124] 如下制备用于分析的样品：通过将利那洛肽胶囊的内容物加入0.1 NHC1中，得到 20yg利那洛肽/mL的目标浓度。将100yL该溶液注射到柱上。
[0125] 通过相对于类似地制备的外部利那洛肽标准品测定制备的样品中的利那洛肽浓 度，测量利那洛肽含量。
[0126] 在图1中显示了通过HPLC分析利那洛肽的一个实例，其中"氧化"表示利那洛肽 氧化产物，"甲醛亚胺"表示利那洛肽甲醛亚胺产物，且"水解"表示利那洛肽水解产物。
[0127] 实施例22:利那洛肽制剂稳定性试验
[0128] 对于实施例1-15和17的制剂，给明胶胶囊填充大约225mg活性珠子。将5个填 充的胶囊放入塑料瓶中。该瓶子装有l-2g干燥剂，并抽气密封（inductionsealed)。将瓶 子在40°C/75%RH储存6个月。
[0129] 基本上如实施例21所述或通过等效方法，测量利那洛肽含量和纯度以及利那洛 肽-相关物质的量。结果提供在表7中。
[0130]表 7
[0131]
[0132]
[0133] 对于实施例16的制剂，给明胶胶囊填充大约113mg总珠子。将35个填充的胶囊 放入塑料瓶中。该瓶子装有2g干燥剂，并抽气密封。将瓶子在40°C/75 %RH储存1个月。
[0134] 基本上如实施例21所述或通过等效方法，测量利那洛肽含量和纯度以及利那洛 肽-相关物质的量。结果提供在表8中。
[0135]表8
[0136]
[0137] 实施例23:利那洛肽水解产物的分离和制备
[0138] 随着在7位的Asn转化成Asp(利那洛肽的编号在N-末端Cys从1开始），产生利 那洛肽水解产物。它的结构如下所述：
[0139]
[0140] 使用标准的固相肽合成技术，已经独立地合成了用于证实身份的利那洛肽水解产 物。还可以通过本领域已知的其它方法，制备利那洛肽水解产物，例如，通过使用色谱技术 从利那洛肽制备物分离，或通过重组表达编码利那洛肽水解产物（CysCysGluTyrCys CysAspProAlaCysThrGlyCysTyr)的核酸，任选地随后氧化半胱氨酸残基以形成二 硫键。
[0141] 实施例24:利那洛肽甲醛亚胺产物的分离和制备
[0142] 随着经由甲醛-介导的反应向N-末端Cys(Cysl)添加亚胺，产生甲醛亚胺产物。 提出的产物的结构如下所述：
[0143]
[0144] 通过使利那洛肽与甲醛（1:5摩尔比）在无水乙醇中在室温反应4天，已经独立地 合成了用于证实身份的利那洛肽甲醛亚胺产物。还可以通过本领域已知的其它方法制备甲 醛亚胺产物，例如，通过使用色谱技术从利那洛肽制备物分离，或通过化学肽合成或重组表 达编码利那洛肽的核酸，随后如本文所述或通过本领域已知的其它方法甲酰化，任选地随 后氧化半胱氨酸残基以形成二硫键。
[0145] 实施例25:利那洛肽氧化产物的分离和制备
[0146] 利那洛肽氧化产物具有1542. 8的分子量。该氧化产物最可能随着单个氧原子添 加到利那洛肽的6个半胱氨酰硫之一上而形成。下面描述了所述产物的一种可能的结构， 尽管本领域技术人员会认识到，氧原子可以连接到其它5个硫中的任一个上：
[0147]
[0148] 为了支持该鉴别，通过使利那洛肽与过氧化氢（3%水溶液）在室温或40°C反应至 多达24小时，已经生产了利那洛肽氧化产物。得到的产物富含了 1-10%的氧化产物。还可 以通过本领域已知的其它方法制备利那洛肽氧化产物，例如，通过使用色谱技术从利那洛 肽制备物分离，或通过化学肽合成或重组表达编码利那洛肽的核酸，随后氧化半胱氨酸残 基形成二硫键，随后使利那洛肽与过氧化氢或类似的氧化试剂反应，以形成利那洛肽氧化 产物。
[0149] 实施例26:利那洛肽片剂形成
[0150] 流化床造粒
[0151] 将利那洛肽、CaCl2、亮氨酸和聚乙烯吡咯烷酮（PVP)K30溶于0. 0001NHC1中，以 形成包衣溶液（参见表9)。将异麦芽酮糖醇装入流化床的碗中。在使异麦芽酮糖醇粉末流 态化的同时，以~l〇g/min的速度，从上面喷洒药物溶液，产物温度为~40C，以用包衣溶液 包被粉末。完成喷雾后，干燥利那洛肽颗粒30分钟，并卸掉产物。
[0152]表 9
[0153]
[0154] 也使用磷酸二|丐或Avicel作为流化床造粒的填充剂。
[0155] 湿法制粒
[0156] 称量利那洛肽，在搅拌下溶于250g0.INHC1(pH1. 7)中，以形成溶液1(参见表 10)。称量CaCljP亮氨酸，在搅拌下溶于100g0.INHC1中，以形成溶液2。将溶液1和 溶液2在搅拌下混合到一起，以形成包衣溶液。将Avicel加入高切力制粒机的碗中。在 500rpm混合下，将包衣溶液加入Avicel中。加入溶液结束后，混合颗粒，并切割1分钟。将 得到的湿颗粒装入流化床的碗中，干燥15分钟，然后卸掉利那洛肽颗粒。
[0157]表 10
[0158]
[0159] 在湿法制粒配方中，分别在60-100和30-50的范围内，调节CaCl2和亮氨酸与利 那洛肽的摩尔比。另外，在一个实施例中加入蔗糖。参见表11。
[0160]表11
[0161]
[0162] 片剂制剂
[0163] 将利那洛肽颗粒与下述赋形剂（参见表12)相混合，并压制成片剂，硬度为~4kp。
[0164]表12
[0165]
[0166] 基于上面的配方，也将异麦芽酮糖醇、淀粉1500或磷酸二钙用作片剂填充剂（参 见表13)。
[0167]表 13
[0168]
[0169] 在40°C和75%相对湿度储存2周后，在表13中所述的所有片剂表现出大于90% 的利那洛肽试验值。
[0170] 实施例27-53:利那洛肽制剂的制备
[0171] 基本上如制剂方案A和实施例1-15所述，生产实施例27-53的利那洛肽制剂。 利那洛肽包衣溶液含有〇. 7 %粘合剂（w/v)，并如实施例1-15所述，将包衣溶液喷雾到 CelphereCP-305珠子上。表14提供了阳离子的类型、胺和/或其它赋形剂的类型以及它 们相对于利那洛肽的摩尔比、以及使用的粘合剂的类型，而表15提供了包被珠子的条件：
[0172]表 14
[0173]
[0174]
[0175] * "阳离子"表示在该实施例中使用的盐含有的阳离子，"胺"表示空间阻碍的伯胺， "摩尔比"表示阳离子：胺：利那洛肽：添加剂（如果使用）的摩尔比。
[0176]表 15
[0177]
[0178]
[0179] 对于实施例32(藻酸钙）、34(硬脂酸钙）和43(CaCl2:维生素E)，在喷雾到珠子 上的过程中，发生加工问题。因而，将包衣溶液与Celphere珠子一起混合，并在托盘上干燥 珠子。
[0180] 实施例54:利那洛肽制剂稳定性试验
[0181] 对于实施例27-53的制剂，给明胶胶囊填充大约225mg活性珠子（600yg利那洛 肽/胶囊）。将5个填充的胶囊放入塑料瓶中。所述瓶子含有lg干燥剂，并抽气密封。将 瓶子在40°C/75%RH储存3个月或6个月。
[0182] 基本上如实施例21所述或通过等效方法，测量利那洛肽含量（yg/mg)和色谱纯 度百分比（％CP)。结果提供在表16A(3个月稳定性）或表16B(6个月稳定性）中。
[0183]表 16A
[0184]
[0185] *试验[w/w，最初的％ ]的值的差异性反映了在小规模生产的这些胶囊批次对含 量均匀度的不完美控制。
[0186] 据信，对于实施例32、34和43(参见上面）而言，在加工过程中遇到的困难和得到 的改