疗病症的方法，其中在优选的实施方案中，该组合物包括一种或多 种Toso抗体。
[0172] 在一个具体实施方案中且根据任何上述内容，本发明提供了通过用包括Toso抗体 的组合物治疗有需要的受试者来治疗病症的方法。不受理论束缚，Toso抗体有效治疗运些 病症的一种潜在机制是通过调节Toso活性。在某些实施例中，根据本发明治疗病症的方法 包括施用治疗有效量的本文中所描述的任何Toso抗体，包括了包含SEQ ID NO: 1-62中的任 何一个或多个或其任何变体的抗体。在其他实施方案中，用于治疗病症(包括糖尿病、多发 性硬化、哮喘和癌症）的可溶性Toso蛋白包括了包含与SEQ ID NO: 1-28中的任一个具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的 重链或轻链序列的抗体。所述抗体可W根据本文中所描述的方法进行进一步修饰，包括化 学修饰，W用于治疗本文中所描述的任何病症。
[0173] 在其他方面，本发明设及通过向受试者施用Toso抗体或其变体来治疗病症和疾病 的方法。本发明的抗体可用于治疗罹患不限于W下各项疾病的受试者：自身免疫性病症(包 括但不限于1型糖尿病、多发性硬化或类风湿性关节炎）、2型糖尿病、哮喘、过敏、慢性阻塞 性肺病rCOP护）、高IgM综合征、狼疮、癌症或中性白细胞增多相关病症(包括但不限于中性 粒细胞减少、严重先天性中性粒细胞减少、环形中性粒细胞减少、抗体介导的中性粒细胞减 少、网状细胞发育不全、白细胞粘附缺陷、家族性骨髓增生性疾病、慢性骨髓性白血病、家族 性冷激性等麻疹和白细胞增多W及慢性肉芽肿病）。如应了解，本文中所描述的任何Toso抗 体可W呈单独或任何组合形式用于治疗运些病症或疾病中的任一种。
[0174] 如W上所讨论，在一些实施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白被用于治疗癌症。在 其他实施方案中，根据本发明治疗癌症的方法包括通过调节Toso活性来抑制肿瘤侵袭和/ 或转移的方法。在示例性实施方案中，本发明的组合物用于在有需要的受试者中治疗腺癌、 白血病、淋己瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或崎胎癌组群中任一种。在其他实施方案中，本发明 的组合物用于治疗罹患肾上腺、膀脫、骨、骨髓、脑、胸部、颈、胆囊、神经节、胃肠道、屯、脏、 肾、肝脏、肺、肌肉、卵巢、膜脏、副甲状腺、阴茎、前列腺、唾液腺、皮肤、脾、睾丸、胸腺、甲状 腺或子宫中的一个或多个中的癌症的受试者。
[0Π 日]实施例1:人类原生隧菌体scFv文库构建
[0176] 外周血单核细胞(PBMC)是获自捐赠和市售血样。使用Ficoll-paque TM化US(GE Healthcare)分离PBMC。然后使用Trizol分离总RNA与所分离的PBMC，然后使用得自于To化1 RNA Pr巧S(Ambion)的mRNA纯化用Dyiiafeeads蠻mRNA纯化试剂盒从总RNA中纯化mRNA。 [ΟΠ 7]使用RT-PCR用Superscript III第一股合成系统（Invitrogen)由mRNA进行第一股 cDNA合成。汇集cDNA文库且测量浓度。
[0178] 使用60至90ng cDNA作为模板和2.5μ1所提供的各恒定和可用区DNA引物组1 (F2000，Progen)、2扣12XterraPCR缓冲剂、lμlterra聚合酶混合物，W50μl的总体积分 别扩增可变κ、λ和丫链基因。PCR条件:95°C，30秒(变性）；55°C，lmin(退火）；和75°C，lmin (延长），总计30个循环。在第一个循环开始时，将反应混合物在95°C下解育3min且在最后一 个循环结束时在75°C下解育5min。
[0179] 为了引入限制位点，在含有W下各物的总计50μ1中进行PCR:lyl可变基因 PCR产物 (分别使用κ、λ和丫链基因作为模板）、2.扣1所提供的各恒定和可变区DNA引物组2(F2000， Progen)、2化1 2XterraPCR缓冲剂、1μ1 terra聚合酶混合物。PCR条件：95°C，30秒（变性）； 57°C，lmin(退火）；和75°C，lmin(延长），总计14个循环。在第一个循环开始时，在95°C下解 育3min且在最后一个循环结束时在75°C下解育5min。使用凝胶DNA提取试剂盒(Clontech) 纯化PCR产物。汇集分别经纯化的κ、λ和丫 DM。
[0180] 通过W下方式将轻链DNA克隆到隧菌粒载体PSEX81中：通过添加25μ1缓冲液Η、化1 Notl (40ιι/μ1)和0.化1 RNA酶Α( lOyg)消化lOyg隧菌粒载体PSEX81 (Progen)，总体积是22化 1。混合并且在37°C下解育8min，随后加入20μ1 MluI(lOuAU)，在37°C下解育6min。在那之 后，添加碱性憐酸酶（CIP)且在37°C下继续解育15分钟。然后，添加0.25μ1 0.5M pH 8.0EDTA，随后在65°C下解育20min。使混合物在凝胶上跑电泳且切下含有MluI/NotI- pSEXSl片段的凝胶带并使用凝胶DM提取试剂盒进行提取。然后通过添加7.化1缓冲液Η、 0.9μ1 Notl (40ιι/μ1)分别消化1.扣g所汇集的Κ和所汇集的λ链PCR产物，在37°C下解育 2〇111111，然后添加化111111(1〇11/41)，随后在37°(：下进一步解育40分钟。用1.5%琼脂糖凝胶 对反应产物进行跑电泳且切下40化P的条带并使用凝胶DNA提取试剂盒进行纯化。使用介于 1:1与1:3之间的摩尔比将经消化的载体(PSEX81)和插入物(K或λ可变链基因）连接。反应混 合物包括50ng DNA、1U Τ4连接酶、连接缓冲剂和此0，最终体积是15μ1。在16 °C下解育过夜 之后，通过添加1 /10体积的3M乙酸钢、20yg糖原、2.5倍体积的绝对乙醇使DNA沉淀。在-20°C 下解育1.5小时，随后通过在13，000巧m下离屯、30分钟使沉淀物沉降。用80%乙醇将球粒洗 涂至少两次，然后允许球粒在室溫下干燥。使经过干燥的球粒再悬浮于2至化1肥0中。
[0181] 然后通过W下方式将重链DNA克隆到含有轻链DNA的PSEX81载体中：分别用10μ1 Hindlll(lOu/μΙ)、25μ1缓冲液Η、0.扣1 RNA酶Α(lOyg)消化lOyg含轻链的载体(Κ-Ρ沈Χ81 和 λ-pSEXSl)，总体积是230μ1，在37°C下解育20min，然后添加10μ1 NcoKlOu/μΙ)，然后在37 °C下解育90分钟。用于消化载体的其余程序与上文所述相同。为了消化重链插入物，用 7.5ul 10X缓冲液H、2.7ul Hindm(10u/ul)、4ul Ncol(10u/ul)消化化g所汇集的丫链 PCR产物，总体积是7扣1，随后在37°C下解育4小时，然后在65°C下解育20min。使用凝胶DNA 提取试剂盒纯化经过消化的DNA。如上所述完成DNA的连接和沉淀。
[0182] 通过W下方式建立文库储备液:将1.扣1的一种连接反应物用于40μ1电感受态大 肠杆菌化-蓝(Stratagene)的电穿孔。将连接DNA文库的各转化接种到S0B-GA琼脂板上且在 30°C下解育过夜。将6ml2XYT-GA培养基添加至各板并且将细菌刮到培养基中。汇集细胞并 且制成甘油储备液。
[0183] 实施例2:文库的生物淘选
[0184] 在37°C下在W25化pm振荡的情况下使接种培养物生长，直至达到Asgg为0.1。添加 M13K07辅助隧菌体，然后在37°C下在不振荡的情况下将培养物解育15分钟，然后在37°C下 在W25化pm振荡的情况下解育1小时。在1500g下使细胞球粒化lOmin，然后再悬浮于400ml 2 X YT-AK培养基中。在30°C下在W25化pm振荡的情况下使悬浮液生长过夜。旋转培养物，然 后使用PEG溶液使隧菌体沉淀。测定隧菌体的效价。可W制造甘油储备液或文库可W直接用 于淘选。
[018引 nunc 96孔板中两个孔涂布有200μ1/孔含100μg/ml经纯化的Toso-Fc的PBS溶液； 两个孔涂布有 200μ1 100μg/ml rhIgG Fc(Sino Biological Inc.);向另2个孔中添加 200μ 1 5%牛奶PBS(MPBS)(无抗原），并且在4°C下将板解育过夜。
[0186] 从原生文库中取出0.6ml l〇i2p化/ml隧菌体到1.5ml管中，向管中加入蛋白G珠粒， 然后在4Γ下在旋转下将管子解育过夜。
[0187] 次日早晨倒空Toso-Fc涂布的孔且用PBST洗涂3次，并且用250ul 5%MPBS阻断，随 后在室溫下解育2小时。
[0188] 将rhIgG Fc(Sino Biological Inc.)涂布的孔倒空。对隧菌体-蛋白G珠粒溶液进 行离屯、并且将10化1上清液转移到两个rhIgG化涂布的孔中的每一个中。W10化1/孔加入 lOOug/ml rhIgG Fc(Sino Biological Inc.)，且在室溫下解育 1 小时。
[0189] 将未经蛋白质涂布的孔倒空且将隧菌体溶液个别地转移到未经蛋白质涂布的孔 并且在室溫下解育1小时。
[0190] 从Toso-Fc涂布的孔中去除阻断缓冲液，然后用PBST洗涂若干次。将20化1隧菌体 溶液转移到Toso-Fc涂布的孔并且在室溫下解育1.5小时。
[0191] 将Toso-Fc涂布的孔倒空，并且用PBST洗涂若干次。通过向两个孔中的每一个中加 入20化1 1 ΟΟπιΜΞ乙胺随后解育10分钟来洗脱隧菌体。
[0192] 将洗脱的隧菌体转移到2X1.5ml含有800ul 1Μ化is-HCl(抑7.5)的管中^中和 抑值。
[0193] 使用2 XlOul洗脱的隧菌体来进行滴定。将其余洗脱的隧菌体用于感染10ml新鲜 TG1细胞(0〇6〇〇 = 0.4)。将200ul的运种样品散布在含有lOOul/ml氨节青霉素和1%葡萄糖的 2χΥΤ琼脂板上，在32°C下生长过夜。在37°C下在W25化pm振荡的情况下将其余被感染的细 胞解育1小时，此后用含有lOOug/ml amp的2χΥΤ培养基将体积增至110ml，随后在37°C下在 W 25化pm振荡的情况下解育。
[0194] 将M13K07辅助隧菌体（100μΙ l〇i2p化)加入到被感染的培养物中且也在37°C下生 长，还向培养物中加入卡那霉素，最终浓度是50μg/ml。在37°C下在W25化pm振荡的情况下 将运种培养物解育过夜，W用于下一轮淘选。
[0195] 尽管上文已经在某种详细程度上或参考一个或多个个别方面描述了运种技术的 不同方面，但本领域技术人员可W对所公开的方面进行许多变化而不背离此技术的精神或 范围。因为许多方面可W在不背离本发明所描述的技术的精神和范围的情况下进行，但适 当的范围存在于W下所附的权利要求书中。因此涵盖其他方面。此外，应理解，除非另外明 确要求或权利要求书的措辞内在地使得有必要按特定顺序，否则任何操作都可W按任何顺 序进行。意在W上描述中所含有的和附图中所示出的所有物质都应解释为仅说明具体方面 且不限于所示的实施方案。除非从上下文显而易见或明确陈述，否则本文中所提供的任何 浓度值一般相对于混合物值或百分比给出，而不考虑添加混合物的特定组分时或之后发生 的任何转化。在未明确并入本文中的程度上，本公开内容中所提及的所有公开参考文献和 专利文件都出于所有目的W全文引用的方式并入本文中。可W在细节或结构上进行变化而 不背离如W下权利要求书中所定义的本发明技术的基本要素。
【主权项】
1. 一种抗体，其包含含有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57 中的任一个的重链可变区。2. -种抗体，其包含具有与SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、 31、 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57 中的任一个具有至少约 95% 序列同一性的 序列的重链可变区，其中所述抗体结合Toso。3·-种抗体，其包含含有SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58中的任一个的轻链可变区。 4·一种抗体，其包含具有与SEQIDN0 :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58中的任一个具有至少约95%序列同一 性的序列的轻链可变区，其中所述抗体结合Toso。5. -种抗体，其包含:第一重链⑶R，其包含表1中所列出的⑶R1序列中的任一个;第二 重链⑶R，其包含表1中所列出的⑶R2序列中的任一个;第三重链⑶R，其包含表1中所列出的 ⑶R3序列中的任一个;第一轻链⑶R，其包含表2中所列出的⑶R1序列中的任一个;第二轻链 CDR，其包含表2中所列出的CDR2序列中的任一个;和第三轻链CDR，其包含表2中所列出的 ⑶R3序列中的任一个，其中所述抗体结合Toso。6. 如上述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。7. -种核酸，其编码如上述权利要求中任一项所述的抗体。8. -种表达载体，其中所述表达载体编码根据权利要求1至5所述的抗体。9. 一种制造根据权利要求1至5所述的抗体的方法，所述方法包括提供包含编码所述抗 体的核酸的细胞，其中在适合于表达所述抗体的条件下培养所述细胞。10. -种治疗Toso相关疾病的方法，所述方法包括用根据权利要求1至5所述的抗体治 疗有需要的受试者。
【专利摘要】本发明提供了用于调节TOSO活性以及治疗牵涉TOSO的疾病和病症的方法和组合物。所述方法和组合物包括使用一种或多种结合TOSO蛋白或TOSO蛋白配体的抗体。
【IPC分类】A61K39/395, C07K16/28, C07K16/46, C12P21/08, C12N15/63, C12N15/13
【公开号】CN105683218
【申请号】
【发明人】T.W.马克, X.赖, M.W.图舍
【申请人】大学保健网络
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年7月2日