达结合于膜的IL-15和 4-IBB配体（CDI37L)。此类细胞系包括，但不是必须限于K562[ATCC、CCL 243;Lozzio等， Blood 45(3) :321-3：M(1975);Klein等，Int.J.Cancer 18:421-431(1976)]，和Wi 1ms肿瘤 细胞系HFWT，[Fehniger Τ A，Cal igiuri Μ A. Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001) ;Harada H,等，Exp Hematol 32(7) :614-621(2004)]，子宫内膜肿瘤细胞系HHUA、黑 色素瘤细胞系HMV-II型、肝母细胞瘤细胞系化H-6、肺小细胞癌细胞株Lu-130和Lu-134-A、 神经母细胞瘤细胞系NB 19和N1369,来自睾丸肥C 14的胚胎性癌细胞，宫颈癌细胞系TC0-2 W及骨髓转移神经母细胞瘤细胞系TNB 1阳arada H.，等，Jpn.J.Cancer Res 93:313-319 (2002)]。较佳地，所用的细胞系缺乏MHC I和II分子或表达不佳，如K562和HFWT细胞株。可 采用固体支持物来代替细胞系。较佳地，此类支持物应在其表面附有至少一种分子，该分子 能结合NK细胞和诱导初级活化事件和/或增殖反应或能够结合具有此类作用的分子，藉此 用作支架。该支持物可在其表面附有CD 137配体蛋白、CD 137抗体、化-15蛋白或IL-15受体 抗体。较佳地，该支持物在其表面结合有IL-15受体抗体和CD 137抗体。
[0084] 本发明的组合疗法
[0085] 本发明描述的组合物和方法可与其他种类的癌症治疗方法，如化疗、手术、福射、 基因治疗等联用。此类疗法可与本发明的免疫疗法同时或按顺序(按任何顺序)实施。
[0086] 当与额外的治疗剂联合给药，因其相加作用或协同作用可降低各试剂的适宜的有 效治疗剂量。
[0087] 本发明的治疗可W结合其它免疫调节治疗，例如治疗性疫苗(包括但不限于GVAX、 DC疫苗等）、检查点抑制剂（包括但不限于阻断(：化44、？01、1^\63、1'這3等的试剂）或活化剂 (包括但不限于增强41BB、0X40等试剂）。
[0088] 可与本发明免疫疗法联用的其它治疗剂的非限制性例子包括：
[0089] (i)抗血管生成试剂(例如，TNP-470,血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白 酶组织抑制剂(TIMP巧日TIMP2)、催乳素（16-Kd片段）、血管抑素(血纤维蛋白溶酶原38-Kd片 段）、内皮抑素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素 α、可溶性KDR和FTkl受体、胎盘增 殖蛋白相关的蛋白，W及化rmeliet and化in(2000)中所列举的那些）；
[0090] (i i) VEG巧吉抗剂或VEGF受体括抗剂，如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片 段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂、及其任何 组合；
[0091 ] (i i i)化疗化合物，例如，喀晚类似物(5-氣尿喀晚、氣尿巧、卡培他滨、吉西他滨和 阿糖胞巧）、嚷岭类似物、叶酸括抗剂和相关抑制剂(琉基嚷岭、硫鸟嚷岭、喷妥司汀和2-氯 脱氧腺巧(克拉屈滨））；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物，如长春花生物碱(长春花碱、 长春新碱、长春瑞滨），微管干扰素，如紫杉烧(紫杉醇、多西紫杉醇）、长春新碱、长春花碱、 诺考达挫、埃坡霉素和长春瑞滨，表鬼白毒素(日91山9〇(1〇地如1〇扣义山3)(足叶乙武，替尼泊 武）、DNA损伤剂(放线菌素、胺苯叮晚、蔥环霉素、博莱霉素、白消安、喜树碱、卡销、苯下酸氮 芥、顺销、环憐酷胺，环憐酷胺(切toxan)，放线菌素 D，柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、六亚甲 基二胺、奥沙利销、异环憐酷胺、马法兰、氮芥(merchlorehtamine)、丝裂霉素、米托蔥酿、亚 硝基脈、普卡霉素(plicamycin)、甲基节阱、紫杉醇、泰索帝、替尼泊武、Ξ亚乙基硫代憐酷 胺和依托泊巧（vpl6));抗生素，如更生霉素(放线菌素 D)、柔红霉素、阿霉素（亚德里亚霉 素），去甲氧柔红霉素、蔥环霉素、米托蔥酿、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素;酶 α-天冬酷胺酶，其系统性代谢心天冬酷胺和剥夺没有能力合成自身的天冬酷胺的细胞）； 抗血小板药物;抗增殖/抗有丝分裂烷基化剂，如氮芥（二氯甲基二乙胺、环憐酷胺和类似 物，马法兰，苯下酸氮芥）、乙締亚胺和甲基Ξ聚氯胺(六甲基Ξ聚氯胺、嚷替赃）、烷基横酸 盐-白消安（卡氮芥（BCNU)和类似物，链脈菌素），S嗦一达卡己嗦（trazenes- dacarbazinineKDTIC);抗增殖/抗有丝分裂代谢物，如叶酸类似物（甲氨蝶岭）；销配合物 (顺销、卡销）、甲基节阱、径基脈、米托坦、氨鲁米特;激素、激素类似物(雌激素、Ξ苯氧胺、 戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香化酶抑制剂(来曲挫，阿那曲挫）；抗凝剂(肝素、合成 肝素盐和其他凝血酶抑制剂）；纤维蛋白酶溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激 酶）、阿司匹林、双喀达莫、嚷氯匹定、氯化格雷、阿昔单抗;抗迁移剂;抗分泌剂(布雷菲德菌 素-breveldin);免疫抑制剂(环抱霉素、他克莫司（FK 506)、西罗莫司（雷帕霉素）、硫挫嚷 岭、霉酪酸醋）；抗血管生成化合物(如TNP-470、金雀异黄素、贝伐单抗)和生长因子抑制剂 (如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂）；血管紧张素受体阻滞剂;一氧化氮供体;反义寡核 巧酸;抗体（曲妥珠单抗）；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸）;mTOP抑制剂，拓扑异构 酶抑制剂（多柔比星（阿霉素）、胺苯叮晚、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、替尼泊巧 (eniposide)、表阿霉素、足叶乙武、去甲氧柔红霉素和米托蔥酿，拓扑替康，伊立替康），糖 皮质激素(可的松、地塞米松，氨化可的松、甲基强的松龙(methylpednisolone)、泼尼松和 氨化波尼松(prenisolone));生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和半 脫天冬酶活化剂;和染色质干扰素。
[0092] 其它的有用试剂示例也可参见《医师案头参考》(化ysician's Desk Reference), 第59.版，（2005)，Thomson P D R，蒙特威尔，N.J.;Gennaro等编，《雷明顿药学科学和实践》 (Remington's The Science and Practice of Pharmacy)第20版，（2000),利平科特?威 廉斯?威尔金斯出版公司，己尔的摩，马里兰州;Braunwald等编.《哈里森内科原理》化arri son's Principles of Internal Medicine),第15版，（2001),麦格劳-希尔集团，纽约； Berkow等编，默克诊断和治疗手册（The Merck Manual of Dia即osis and Therapy)， (1992)，默克研究实验室，拉威，新泽西州。
[0093] 不作进一步阐述，应相信，基于上述描述，本领域技术人员可在完整的范围内利用 本发明。因此，W下【具体实施方式】应视为仅仅是说明性的，而非W任何方式限制本发明的其 余部分。出于本文引用的目的或主题，本文所引的所有出版物通过引用纳入。 实施例
[0094] 也借助下列实施例描述和说明本发明。然而，利用运些实施例和说明书任意地方 的其他实施例只是说明性的，绝非要限制本发明或任何示例性术语的范围和意义。同样地， 本发明不限于任何在此描述的特定优选实施方案。事实上，在阅读本说明书后，本发明的多 种修饰和变化对本领域技术人员是明显的，并且可不脱离本发明的实质或范围来作出此种 变化。
[00巧]材料和方法
[0096] 细胞
[0097] 人B系淋己瘤细胞系化udi和Ramos，Τ细胞急性淋己细胞白血病细胞系化rkat，和 神经母细胞瘤细胞系CHLA-255、NB1691和SK N甜获自圣朱迪儿童研究医院（Stjude化i Idren's Research Hospital)。乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC HTB-22)，SK-BR-3(ATCC HTB- 30)和骨肉瘤细胞系U-20S(ATCC HTB-96)获自美国典型培养物保藏中屯、(ATCC;罗克维尔， MD);胃癌细胞系MKN7来自国家生物医学创新研究所（大阪，日本）。Daud i、畑LA-2 5 5、 NB169USK-N-甜、51(-81?-3、]\〇^-7、1]-205和]\1脚7也用含巧火虫巧光素酶基因的小鼠干细胞 病毒(MSCV)-内部核糖体进入位点（IRES)-绿色巧光蛋白（GFP)逆转录病毒载体转导（藤崎 等，Cancer Res .，2009; 69(9): 4010-4017)。通过FACSAria细胞分选仪(BD生物科学公司-BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)选择转导细胞的绿色巧光蛋白表达情况。来自新诊断 的并未治疗的B慢性淋己细胞性白血病(CLL)患者的外周血或骨髓样本经知情同意和经管 理新加坡国立大学医院的特定领域伦理委员会批准获得。
[0098] 外周血样品来自健康成年献血者血小板捐献物的去识别化副产品。单核细胞通过 离屯、富集在Accu-Prep人淋己细胞细胞分离介质上（ACS公司-Accurate化emicalfe Scientific Co巧.，韦斯特伯里，纽约），并用抗-CD3/CD28珠(英杰公司，卡尔斯己德，加利 福尼亚州）在含10%胎牛血清(FBS)、抗生素、100 IU白细胞介素（IL)-2(罗氏，曼海姆，德 国）的RPMI-1640 中培养 3 天。在第4天，用〔014、〔016、〔019、〔036、〔056、〔0123和〔0235曰抗体 和磁珠的混合物作阴性选择来纯化T细胞（全T细胞分离试剂盒Π ;ΜΒ公司-Miltenyi Biotec，贝尔吉施格拉德己赫，德国）（纯度>98% )。纯化的T细胞保存在上述介质中，每隔一 天加入100IU的IL-2。
[0099] 质粒、病毒产生和基因转导
[0100] pMSCV-IRES-GFP、祀Q-PAM3 (-E)和P畑F获自圣朱迪儿童研究医院载体开发和生产 共享资源（孟菲斯，田纳西州KFCRG3A CDNA获自化igene公司（罗克维尔，马里兰州），其 V158F变体使用引物"F"CTTCTGCAGGGGGCTTGTTGGGAGTAAAAATGTGTC(SEQ ID NO. :7)和"R" GACACATTTTTACTCCCAACAAGCCCCCTGCAGAAG(SEQ ID NO. :8)，通过PCR定点诱变生成。编码 〔08曰较链区和跨膜区的多核巧酸(569 10^.:11)，4-188(沈9 10^.:12)和〔03((569 10 ^:13)胞内区从先前制备的抗-〔019-4188-〔03(〔0麻亚克隆得到。参见1111曰1等，1^6111?51111曰 2004; 18 :676-684。运些分子通过PCR重叠延伸而剪接组装。将构建体（"CD16F-BB-C"和" CD16V-BB-C")和表达盒亚克隆入MSCV-IRES-GFP载体的EcoRI和MLul位点。
[0101] 为了生成RD114-假逆转录病毒，利用化GE肥6或X-化emeGE肥9(罗氏，印第安纳 波利斯，印第安纳州），用3.扣g编码CD16V-BB-C的CDNA、3.5yg祀Q-PAM3(-E)和化g P畑F转 染3x10? 293T细胞（Imai等，Leukemia 2004; 18:676-684)。在24小时时用含 10%FBS的 RPMI-1640替换培养基，在48-96小时后得到含有逆转录病毒的培养物，并将其加到包被有 Re化oNectin(化kaRa，大津，日本)的聚丙締试管中，在1400g下离屯、10分钟，在37°C溫育6小 时。在离屯、分离并除去上清液后，将T细胞(IX 105)加到试管中，在37°C下放置24小时。细胞 在含有FBS、抗生素和lOOIU/mL比-2的RPMI-1640中保存直到试验时间（转导后7-21天）。
[0102] 通过使用R-藻红蛋白偶联的抗人CD16(克隆B73.1，抓BP公司-BD Biosciences Pharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚州）的流式细胞仪分析CD16的表面表达。将2x107T细胞 在含有1%蛋白酶抑制剂混合物（西格玛公司-Sigma)和1%憐酸酶抑制剂混合物2(西格玛 公司）的Cellytic Μ裂解缓冲液（西格玛公司，圣路易斯，密苏里州）中裂解，W用于蛋白质 免疫印迹。离屯、后，在有或没有还原缓冲液(英杰公司）存在下，裂解上清液用等体积的LDS 缓冲液(英杰公司，卡尔斯己德，加利福尼亚州）煮沸，然后用NuPAGE Novex 12%Bis-化is 凝胶(英杰公司）分离。蛋白质被转移到聚偏氣乙締(PVDF)膜上，然后用小鼠抗人CD3C(克隆 8D3;抓BP公司-BD eBioscience陆armingen)溫育，然后用山羊抗小鼠 IgG辣根过氧化物酶 偶联的二抗(细胞信号传导技术公司Cell Signal ing Technology,丹弗斯，马萨诸塞州） 溫育。通过使用Amersham E化Prime检测试剂(GE医疗集团）掲示抗体结合。
[0103] mRNA 电穿孔
[0104] pVAXl载体(英杰公司，卡尔斯己德，加利福尼亚州）被用作体外mRNA转录的模板。 将CD16V-BB-CCDNA亚克隆到pVAXl的EcoRI和Xbal位点。利用T7 mScript mRNA生产系统（CS 公司-CellSc;ript，麦迪逊，威斯康星州）在体外转录相应的mRNA。参见，例如化imasaki等， Cytotherapy,2012；14(7)：830-40〇
[01化]电穿孔法使用了Amaxa Nucleofector (隆萨公司-Lonza，沃克斯维尔，马里兰州）。 用细胞系核转染试剂盒V(Cell Line Nucleofector Kit V，隆萨公司）混合用200IU/mL 化-2过夜活化的lx ΙΟ7纯化的Τ细胞与20化g/mL mRNA,转入处理室，并采用程序X-001转 染。电穿孔后立即将细胞从处理室转入24孔板、然后在含有FBS、抗生素和lOOIU/mL化-2 (罗氏，曼海姆，德国）的RPMI-1640中培养。也参见Siimasaki等，Cytotherapy，2012，l-ll。
[0106] 抗体结合、细胞接合和细胞增殖试验
[0107] 为了测量嵌合受体的抗体结合能力，4Γ下，将经嵌合受体或只含GFP的载体转导 的T淋己细胞(5X105)与利妥昔单抗(美罗华，罗氏；O.l-lyg/mL)、曲妥珠单抗(赫赛汀；罗 氏；0.1 -1 yg/mL)和/或纯化的人I gG (研发系统公司-R&D SyStems，明尼阿波利斯，明尼苏达 州；O.l-lyg/mL)溫育30分钟。憐酸盐缓冲盐(PBS)洗涂两次后，将细胞与山羊抗人IgG-PE (SBA公司-Southern Biotechnology Assoc iates，伯明翰，阿拉己马州）在室溫下溫育10 分钟，使用Accuri C6流式细胞仪(抓生物科学公司-BD Biosciences)检测细胞染色。
[0108] 为了确定与受体结合的抗体是否促进细胞聚集，用CellTrace巧黄绿素红一澄AM (英杰公司）标记CD20阳性Daudi细胞，然后与利妥昔单抗(O.lyg/mL)在4°C下溫育30分钟。 PBS洗涂两次后，细胞与用嵌合受体转导或模拟转导的化rkat细胞在37 °C下在96圆底平板 (Costar，康宁，NY)中Wl:lE:T比例溫育60分钟。用流式细胞仪检测形成异源细胞聚集体 (巧黄绿素 AM-GFP双阳性)的细胞比例。
[0109] 为了检测细胞增殖，将经嵌合受体转导或模拟转导的IX 106Τ细胞置于24孔板 (Cos化r，康宁，纽约）的含FBS、抗生素和50IU/mL化-2的RPMI 1640中的孔中。Daudi细胞用 Streck细胞防腐剂（斯特雷克实验室-Shec