IgG，P< 0.0001)。
[0030]图5显示了结合于CD16V-BB-C受体的免疫球蛋白引起T细胞活化，裂解颗粒的胞吐 和细胞增殖。A.经包含GFP(模拟)或包含GFP和CD16V-BB-C的载体转导的T淋己细胞在包被 利妥昔单抗的微量滴定板中培养48小时，无 IL-2;用流式细胞术检测CD25的表达。B.A栏所 示测试结果的概要显示了 GFP+细胞中的CD25表达(来自Ξ个献血者的Τ细胞实验的平均值 ±SD);在利妥昔单抗r'Ab")存在下，经CD16V-BB-C转导的Τ淋己细胞中CD25的表达显著高 于其他实验条件(P含0.003)。C.经包含GFP的载体(模拟)和包含GFP和CD 16V-BB-C的载体转 导的来自四个献血者的T淋己细胞用A的条件(n = 3)培养4小时或与Daudi细胞(n = 3)培养4 小时；用流式细胞术检测CD107a染色。各栏显示了6个实验的平均值±50;在利妥昔单抗 r'Ab")存在下，经CD 16V-BB-C转导的T淋己细胞中CD 107a的表达明显更高于其他实验条件 (P<0.0001)。0 .在有或没有Daudi细胞存在下，单独培养或用利妥昔单抗培养模拟-或 CD16V-BB-C-转染的T淋己细胞最多四周。符号显示了与输入细胞的数量相比的细胞恢复百 分比（来自Ξ个献血者的T细胞实验的平均值±SD)。
[0031] 图6显示了体外CD16V-BB-CT淋己细胞介导的抗体一依赖细胞毒性。A.在对应抗体 存在下，模拟一或CD16V-BB-C-转导的T淋己细胞介导的针对癌细胞系的细胞毒性的典型实 施例。每个符号显示了一式Ξ份培养物的平均值（P<〇. 01，配对t检测法检测所有Ξ组比 对）。完整的数据示于图7"B.在有或没有利妥昔单抗（"Ab")存在下，模拟-或CD16V-BB-巧专 导的T淋己细胞针对来自慢性淋己细胞白血病(Oi)患者原代细胞的细胞毒性。每栏(每个 患者用不同的阴影)对应于2:化:T比的一式Ξ份4小时实验检测到的平均（±SD)细胞毒性。 CD16V-BB-CT细胞和抗体的细胞毒性明显更高于其他3个条件下测得的细胞毒性（P< 0.0001，t测试）；用模拟转导T细胞，添加抗体提高细胞毒性(P = 0.016);所有其它比对:P〉 0.05。C.在间充质基质细胞(MSC)存在下，24小时后W1:沈:T的比例针对B中测试的相同化L 样本的细胞毒性。每栏对应于两个测试的平均值。CD16V-BB-C和抗体的细胞毒性明显更高 于单独使用抗体(P = 〇.0002)或单独使用细胞的（P<0.0001)，单独使用抗体的细胞毒性明 显更高于单独使用细胞的(P = 〇. 0045)。
[0032] 图7显示了 4小时体外细胞毒性试验的总体结果。模拟-或CD16V-BB-CT淋己细胞与 所示的细胞系和非反应性人免疫球蛋白（"无 Ab")或和相应抗体（"Ab")-起培养。Daudi和 Ramos用利妥昔单抗，MCF-7、SK服-3和MKN-7用曲妥珠单抗，W及CHLA-255，NB1691，SK-N-甜 和U-20S用hul4.18K322A。与没有T细胞和/或抗体培养的肿瘤细胞相比，显示了2:1比例 (CHLA-255为4:1)下的细胞毒性。NB1691和SK-BR-3的结果对应于用3个献血者的T淋己细胞 进行的一式Ξ份试验的均值（±SD)细胞毒性，其余细胞系的结果对应于1个献血者的试验； Daudi的结果是2个献血者的一式Ξ份试验的均值(+SD)细胞毒性W及来自另外4个献血者 的T淋己细胞的单独试验。在不存在T细胞时添加利妥昔单抗、曲妥珠单抗或hul4.18K322A 时的均值细胞毒性<10。
[0033] 图8显示了CD16V-BB-CT淋己细胞的细胞毒性是强的、特异性的，并且不受未结合 IgG的影响。A.CD16V-BB-CT淋己细胞与神经母细胞瘤细胞系NB169巧日非反应性人免疫球蛋 白（"无 Ab")或hul4.18K322A抗体（"Ab")共培养24小时。结果对应于一式Ξ份实验的平均 (±SD)细胞毒性。即便在1:86:1'。= 0.0002)下，〔016￥-88-(细胞加扣14.181(3224抗体的细 胞毒性仍显著高于单独使用CD16V-BB-CT细胞的。B.在利妥昔单抗或非反应性抗体曲妥珠 单抗或hul4.18K322A存在下，模拟-或CD16V-BB-C转导的T淋己细胞W2:化:T与B细胞淋己 瘤细胞系Daudi共培养4小时。结果对应于一式立份实验的平均（±SD)细胞毒性。（"模拟"结 果是每个抗体的一式Ξ份实验的总和）。利用利妥昔单抗的细胞毒性明显更高于所有其他 实验条件(P<〇.0001与所有比较）dC.在各种浓度的免疫治疗抗体和竞争性的未结合IgG(同 时加入到抗体)存在下，8:1E:T下，表达CD16V-BB-C的Τ淋己细胞针对肿瘤细胞系的细胞毒 性。符号对应于对每个抗体浓度下至少一式Ξ份测量的平均值（±SD)。不论未结合IgG的存 在量，对于每种细胞系，细胞毒性在统计学上并非不同。
[0034] 图9显示了表达CD16V-BB-C受体的T淋己细胞具有体内抗肿瘤活性。对N0D-SCID- IL2RGnull小鼠腹膜内注射3X105标记巧光素酶的化udi细胞。第四天起每周一次腹膜内注 射利妥昔单抗（150yg)，四周。在4只小鼠中，不施加其他治疗方法，而在其他5只小鼠中，在 第5和第6天第一次注射利妥昔单抗后再注射表达CD16V-BB-C受体的T淋己细胞（1 X 107腹 膜内；η = 5);其它两组的4只小鼠每只在接受CD16V-BB-CT淋己细胞之前，腹膜内注射RPMI- 1640而非利妥昔单抗，或仅腹膜内注射RPMI-1640介质（"对照"）dA.肿瘤生长的体内成像结 果。每个符号对应一种生物发光测量值;线条连接一只小鼠中的所有测量值。B.每个实验条 件下的代表性小鼠（2只每组）。第3天的腹部影像用增强的灵敏度进行了处理，W显示 CD16V-BB-C+利妥昔单抗组小鼠中肿瘤的存在。当生物发光达5x1〇id光子/秒时对小鼠进行 安乐死。C.不同治疗组小鼠的总生存率的比较。
[00巧]图10证实了表达CD16V-BB-C受体的T淋己细胞在体内具有抗肿瘤活性。对N0D- SCID-IL2RGnull小鼠腹膜内注射3X105的标记巧光素酶的NB1691细胞。第5天起每周一次 地腹膜内注射化14.18K322A抗体(2扣g)，四周。在4只小鼠中不施加其他治疗方法，而在其 他4只小鼠中，在第6和第7天第一次注射抗体后再注射表达CD16V-BB-C受体的T淋己细胞（1 X107腹腔;n = 4);其它两组的4只小鼠每只在接受CD16V-BB-CT淋己细胞之前，腹膜内注射 RPMI-1640而非抗体，或仅腹膜内注射RPMI-1640介质（"对照"）dA.肿瘤生长的体内成像结 果。每个符号对应一种生物发光测量值;线条连接一只小鼠中的所有测量值。B.每个实验条 件下所有小鼠的成像。当生物发光达lxl〇w光子/秒时对小鼠进行安乐死。C.不同治疗组小 鼠的总生存率的比较。
[0036] 图11显示了表达CD16V-BB-C受体T淋己细胞和表达CD16F-BB-C受体的T淋己细胞 之间的功能差异。A.流式细胞散点图显示了用CD16V-BB-C或CD16F-BB-C转导的T淋己细胞 中CD 16(用B73.1抗体检巧U)和绿色巧光蛋白（GFP)的表达。显示了每个象限中的阳性细胞 百分比。B.在利妥昔单抗、曲妥珠单抗和hul4.18K322A的存在下，CD 16V或CD16F受体转导 的T淋己细胞分别与Daudi、SK-BR-3或NB1691细胞培养。所有抗体W0.化g/mL使用。符号表 示相比于输入细胞量的细胞恢复百分比（3个实验的平均值±50);对于所有3种培养物，配 对t测试显示1-3周培养的细胞计数显著不同（Daudi，P = 0.0007;SK-BR-3，P = 0.0164; NB1691，P = 0.022)dC.在不同浓度的利妥昔单抗存在下，表达CD16V-BB-C或CD16F-BB-C受 体的T淋己细胞介导的针对化udi细胞的抗体依赖型细胞毒性。每个符号表示在8:1(左)或 2:1(右化:T下的Ξ种培养物的平均值±SD。含有CD16V-BB-C的T细胞的细胞毒性明显更高 于那些含有CD16F-BB-C的T细胞的细胞毒性(P<0.001，任一个E: T)。
[0037] 图12显示了用于本研究的CD 16嵌合受体的示意图。
[0038] 图13显示了具有不同信号传导域的CD 16V受体的表达。流式细胞散点图显示了活 化的T淋己细胞中，绿色巧光蛋白与CD 16组合的表达（用3G8抗体检测），该T淋己细胞用单 独含有绿色巧光蛋白（GFP)(模拟)或不同CD 16V构建物的载体转导。显示了每个象限中的 阳性细胞百分比。
[0039] 图14显示了与具有不同信号传导特性的CD 16V受体相比，CD16V-BB-C诱导更高的 τ细胞活化，增殖和细胞毒性。A.与Daudi细胞和利妥昔单抗(ο. lyg/m 1)共培养48小时后， 表达不同嵌合受体的T淋己细胞中通过流式细胞术检测的CD25平均巧光强度(MFI)对绿色 巧光蛋白（GFP)MFI的图谱。利用CD16V-BB-C的CD25表达明显更高于那些没有信号传导能力 ("CD16V-截短"）的CD16V-C、CD16V-FceRI 丫或CD 16V所触发的CD25表达。（P<0.0001 通过线 性回归分析）dB.在利妥昔单抗、曲妥珠单抗和hul4.18K322A存在下，各种CD16V受体转导的 T淋己细胞分别与化udi、SK-BR-3或NB1691细胞培养。所有抗体WO.化g/ml使用。符号表示 相比于输入细胞量的细胞恢复百分比（3个实验的平均值±50);对于所有3种培养物，配对t 测试显示利用CD16V-BB-C受体的1-3周培养的细胞计数显著高于利用其它受体的细胞计数 (P<0.0001) X.分别在利妥昔单抗、曲妥珠单抗和hul4.18K322A存在下，表达各种CD16V受 体的T淋己细胞或模拟转导的T细胞对化udi、SK-BR-3和NB1691的ADCC。符号为在所示E:T 下，一式Ξ份培养物的平均值±SD。利用CD16V-BB-C受体的细胞毒性明显高于利用所有其 它受体的细胞毒性(所有对比通过t测试，P<0.0001)，然而模拟转导或经CD16V-截短受体转 导的淋己细胞的细胞毒性彼此并非显著不同（P〉〇.〇5);针对Daudi(P = 0.006)和SK-BR-3(P = 0.019)，利用CD16V-化εΚΙ 丫的细胞毒性明显更高于利用CD3-C的细胞毒性;表达任一受 体的淋己细胞比模拟转导或经CD16V-截短(Ρ<0.01，所有比较)转导的淋己细胞具有更高的 细胞毒性。
[0040] 图15显示了mRNA电穿孔测得的CD16V-BB-C受体的表达。Α.用CD16V-BB-CmRNA或无 mRNA(模拟)电穿孔活化T淋己细胞;24小时后用流式细胞术检测CD16的表达。B.在利妥昔单 抗存在下，测试模拟或CD16V-BB-C电穿孔的T细胞对Ramos细胞系的细胞毒性。符号显示了 平均值± SD百分比细胞毒性(η = 3; P<0.01所有E:化k例下的比较）。
[004。发明详述
[0042] 本发明基于构建新型嵌合受体，该受体增强抗癌抗体在癌症治疗中的功效。表达α 机细胞受体的Τ淋己细胞(Τ细胞的绝大多数)缺乏活化Fc 丫 R且不介导抗体依赖细胞毒性。 Nimmerjahn 等，化 t Rev Immunol.2008;8(l) :34-47。本发明显示了表达由 Fc 丫 R和 T 细胞信 号传导分子组成的嵌合受体应赋予运些细胞ADCC能力，因此，应该显著增加单克隆抗体的 抗肿瘤潜力及其他包含Fc部的抗肿瘤分子，例如，一复合分子，由结合肿瘤表面受体的 配体(例如，细胞因子，免疫细胞受体)与免疫球蛋白的Fc-部或包含Fc的DNA或RNA构成），而 无论祀向的肿瘤抗原。本文所描述的是表达此类嵌合受体的T淋己细胞的抗体导向抗肿瘤 活性。
[0043] 本发明提供了一种嵌合受体，其包含：（i)CD16分子的胞外配体结合区，可W是 F158 FCGR3A或高亲和力的V158 FCGR3A变体；（ii)CD8a的较链区和跨膜区；和（ii)包括CD3 ζ和4-1BB信号传导区。本发明的嵌合受体是具有显著增强对多种肿瘤的抗体治疗功效潜能 的通用嵌合受体。如在下述实施例部分讨论的，当通过逆转录病毒转导在人Τ细胞中表达 时，与另一种含有常见的F158变体的受体相比，本发明的受体对人IgG(包括人源化抗体如 抗-CD20抗体利妥昔单抗)的亲和力显著更高。嵌合受体的接合引起T细胞活化，裂解性颗粒 的胞吐和增殖。在利妥昔单抗存在下，表达CD16V-BB-C的T细胞在较低的效祀比下特异性杀 伤淋己瘤细胞系和原发性慢性淋己细胞白血病(αχ)细胞，即便在骨髓间充质干细胞上进 行化L培养时。抗皿R2抗体曲妥珠单抗触发嵌合受体介导的抗乳腺癌和胃癌细胞的抗体依 赖细胞毒性(ADCC)，抗GD2抗体hul4.18Κ322Α触发嵌合受体介导的抗神经母细胞瘤和骨肉 瘤细胞的抗体依赖细胞毒性。在实施例部分进一步掲示了，组合表达嵌合受体和利妥昔单 抗的T细胞根除免疫缺陷小鼠体内的人淋己瘤细胞，而单独用T细胞或抗体无法做到。为了 加速运项技术的临床转化，本文研发了一种基于嵌合受体mRNA电穿孔的方法，使得受体有 效和瞬时地表达，而不使用病毒载体。
[0044] 定义
[0045] 所使用的术语"嵌合受体"被定义为细胞表面受体，包括胞外配体结合区，跨 膜区和细胞质信号传导区的组合，其不是单个蛋白质上天然发现的。本发明的嵌合受体主 要目的是用于T细胞，但也可用于天然杀伤(NK)细胞。
[0046] 术语"约"或"大约"是指本领域普通技术人员测定的特定值在可接受的错误范围 内，运将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，就本领域的惯例而 言，"约"可指在可接受的标准偏差内。或者，"约"可指给定值的最高±20%，较佳地，最高± 10 %，更佳地，最高± 5 %，更佳地，最高± 1 %的范围。或者，特别是对于生物体系或工艺，运 个术语可指在某值的一个数量级内，较佳地，在2倍内。在申请文本和权利要求中描述特定 值之处，除非另有说明，否则术语"约"是隐含的，且在运种情况下意味着该特定值在可接受 的错误范围内。
[0047] 在本发明的上下文中，在其设及任一本文所引用病症的范围内，术语"治疗"、"疗 法"等意味着缓解或减轻与此类病症相关的至少一种症状，或减缓或逆转运种病症的进展。 在本发明的含义中，术语"治疗"还表示抑制、延缓其发作（即，疾病临床表现之前的时期） 和/或降低疾病发展或恶化的风险。例如，与癌症相关的术语"治疗"可W指消除或减少病人 的肿瘤负荷，或预防、延迟或抑制转移等。
[0048] 如本文所用，应用于剂量或用量的术语"治疗有效的"是指给予有此需要的个体 后，化合物或药物组合物(例如，包含含有本发明嵌合受体的T淋己细胞(和/或NK细胞)的组 合物，和任选还包含肿瘤特异性细胞毒性单克隆抗体或含有Fc部分的另一种抗肿瘤分子 (例如，由结合肿瘤表面受体的配体(例如，细胞因子，免疫细胞受体)与免疫球蛋白的Fc部 分或含有化的DNA或RNA构成的复合分子））的数量足W导致所需活性。在本发明上下文中， 术语"治疗有效的"是指化合物或药物组合物的数量足W延缓表现，抑制进展，缓解或减轻 由本发明方法治疗的疾病的至少一种症状。注意，当施用活性成分的组合时，该组合的有效 量可W包括或不包括各个成分被单独施用时有效的量。
[0049] 与本发明的组合物结合使用的短语"药学上可接受的"是指分子实体和组合物中 的其他成分在生理上是可耐受的且通常当施用给哺乳动物（例如，人）时不会产生不良反 应。优选地，如本文所用，术语"药学上可接受的"是指由联邦管理机构或州政府批准或在美 国药典或其它通常公认的药典中列出的，用于哺乳动物的，并且更特别地是人。
[0050] 如本文所用，术语"个体"是指任何哺乳动物。在一优选实施方案中，所述个体是 人。