触发针对多种肿瘤的抗体依赖细胞毒性的嵌合受体的利记博彩app
【专利说明】触发针对多种肿瘤的抗体依赖细胞毒性的嵌合受体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 基于35U.S.C.§119,本PCT申请要求2013年10月17日提交的美国临时申请61/892， 218,2014年7月18日提交的美国临时申请62/026,243,和2014年9月9日提交的美国临时申 请62/047,916的优先权。所有优先权申请的全部内容通过引用纳入本文。 发明领域
[0003] 本发明设及结合人类免疫球蛋白化部分并递送活化信号的嵌合受体。本发明的嵌 合受体包括高亲和性V158FCGR3A变体、CD8a的较链区和跨膜区、CD3C和4-1BB的信号传导 区。本发明的嵌合受体对利妥昔单抗、曲妥珠单抗、hul4.18K322A和其他治疗性抗体具有高 亲和力，使其可用于增强针对多种癌症的抗体疗法的疗效。
[0004] 发明【背景技术】
[0005] 免疫治疗具备规避耐药性的基因和细胞机制，祀向肿瘤细胞的同时能保留正常组 织的潜能，因此是癌症治疗的有前途的选择。对血液恶性肿瘤的异体造血干细胞移植 化SCT)的结果证明T-淋己细胞可W起到主要的抗肿瘤作用，其中T-细胞介导的移植物抗宿 主病(GvHD)与疾病复发呈负相关，并且免疫抑制停药或输注供体淋己细胞可W包括疾病复 发。Weiden 等，N. Engl. J. Med. ,1979; 1979( 19) :1068-1073 ; Porter 等，N. Engl. J. Med.， 1994;330(2) :100-106;Κο化等，Blood 1995;86(5) :2041-2050;Slavin等，Blood 1996;87
[6] : 2195-2204;A卵elbaum，化Uire,2001 ;411 (6835): 385-389。可 W通过表达具有抗体识 别属性的嵌合信号传导受体使得Τ淋己细胞的反应性偏向癌细胞:连接同源祀标导致Τ-细 胞活化并触发细胞毒性。Eshhar 等，Proc.化 tl. Acad. Sci. USA. 1993; 90(2) :720-724 ; Geiger等，J.Immunol.1999;162(10):5931-5939;Brentjens等，化t.Med.2003;9(3):279- 286;Cooper等，Blood 2003; 101 (4): 1637-1644; Imai等，Leukemia 2004; 18:676-684。输注 表达嵌合受体的自体T淋己细胞的最近临床试验结果为其临床潜力给出了令人信服的证 据。Pule等，化t.Med.2008; 14(11 ):1264-1270 Joder等，OncLive 2011;25;365(8) :725- 733;化enjens等，Blood 2011;118(18):4817-4828;Ti 11等，Blood 2012;119(17):3940- 3950;Kochenderfer等，Blood 2012;1 19( 12):2709-2720 ; Brentjens等， Sci.Transl.Med.2013；5(177):177ral38〇
[0006]癌症免疫治疗的另一个方法是施用单克隆抗体，其可W通过多种机制发挥细胞毒 性，包括促细胞调亡信号、补体结合和抗体依赖细胞毒性（ADCC)。Yu等， N. Engl. J.Med. 2010; 363(14) :1324-1334 ;尸6'甘13等，1(：1111.011。〇1.2010;28(28):4390- 4399;Maloney,N.Engl.J.Med.2012;366(21):2008-2016;Scott等，Nat.Rev.(Mincer 2012; 12(4):278-287;Weiner等，Cell 2012;148(6):1081-1084;Galluzzi等，Oncoimmunology 2012; 1 (1): 28-37.后一种机制发挥主要作用，是源自于通过抗体Fc部分与表达于天然杀伤 细胞（NK细胞）和其他细胞（如中性粒细胞和巨隧细胞）表面的Fc受体（Fc 丫 R)的衔接。 Nimmerjahn等，化t.Rev. Immunol .2008;8(1) :：34-47。化丫 R基因的多态性可W具有明显的 功能性结果，进而影响对抗体治疗的反应。为此，NK细胞表达的编码Fc 丫 RIIIa(FCRG3A或 CD16)的基因的同种型可导致受体在158位具有苯丙氨酸(F)或鄉氨酸(V)残基;在少数个体 上，CD16158V/V具有更高的Fc结合力并与肿瘤细胞杀伤增加和优越的患者反应相关。 Ferris 等，J. Clin. Oncol. 2010; 28(28) :4390-4399 ;1(〇6116等，81〇〇(11997;90(3):1109- 1114; Cadron等，Blood 2002; 99 (3): 754-758; Weng等，J. Cl in. Oncol. 2003; 21 (21): 3940- 3947;Dair〇zzo等，Cancer Res. 2004;64( 13) :4664-4669;Hatjiharissi等，Blood 2007; 110(7) :2561-2564 ;Musolino 等，J.Clin.Oncol. 2008; 26( 11): 1789-1796 ;Bibeau 等， J.Clin.Oncol.2009;27(7):1122-1129;Ahlgrimm等，Blood 2011;118(17):4657-4662; Veeramani等，Blood 2011; 118( 12):3347-3:349。
[0007] 本领域迫切需要研发癌症治疗的新方法和新试剂。 发明概要
[0008] 本发明，至少部分发明，是基于对用于例如癌症治疗的新型嵌合受体的开发。因 此，本文提供了嵌合受体，编码它的核酸，包含该编码核酸的载体，表达该嵌合受体的宿主 细胞，和该宿主细胞在增强个体（如癌症患者）中基于抗体的癌症疗法和/或ADCC效果中的 应用。
[0009] -方面，本发明提供了一种嵌合受体，其包含：（a)CD16分子的细胞外配体结合区； (b)CD8a的较链区和跨膜区；和山)包括4-1BB信号传导区和CD3C信号传导区的胞浆区。在一 些实施方式中，CD 16分子为F158FCGR3A，其胞外配体-结合区可包含(例如，由W下组成)SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，CD16分子为V158FCGR3A变体，其胞外配 体-结合区可包含(例如，由W下组成)SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0010] 本文公开的任一嵌合受体中，CD8a的较链区和跨膜区可包含(例如，由W下组成） SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列;4-1BB信号传导区可包含(例如，由W下组成)SEQ ID N0:4 所示的氨基酸序列，和/或CD3C信号传导区可包含(例如，由W下组成）SEQ ID N0:5所示的 氨基酸序列。
[0011] 本文公开的任一嵌合受体可进一步包含CD8a的信号肤，其位于该嵌合受体的N端。 在一实施例中，该CD8a的信号肤可包含（例如，由W下组成）SEQ ID N0:6所示的氨基酸序 列。
[0012] 在一些实施方式中，所述嵌合受体可包含沈Q ID NO: 1或沈Q ID NO: 15的残基22- 436所示的氨基酸序列。在一实施例中，所述嵌合受体包含(例如，由W下组成)SEQ ID N0:1 或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
[0013] 在另一方面，本发明提供了一种分离的多核巧酸，其包含编码本文公开的任一嵌 合受体的核巧酸序列。在一些实施方式中，编码所述嵌合受体的多核巧酸可包含SEQ ID N0:10或沈Q ID N0:18所示的核巧酸序列，SEQ ID N0:11所示的核巧酸序列，SEQ ID N0:12 所示的核巧酸序列，SEQ ID N0:14所示的核巧酸序列，或它们的组合。在一【具体实施方式】 中，编码所述嵌合受体的多核巧酸包含SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 17所示的核巧酸序列。
[0014] 在另一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码本文所公开的任一嵌合受体的 多核巧酸，其中，所述多核巧酸可操作性地与至少一个调控元件连接W便表达嵌合受体。在 一实施例中，所述载体是病毒载体(例如，逆转录病毒载体或慢病毒载体）。
[0015] 进一步地，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包含本文公开的任一嵌合受体。 在一【具体实施方式】中，所述宿主细胞是τ淋己细胞或NK细胞。在一【具体实施方式】中，所述宿 主细胞是离体活化和/或扩增的T淋己细胞或NK细胞，（例如，T淋己细胞可在有一种或多种 选自下组的试剂存在下被活化：抗-C D 3 / C D 2 8，I L - 2，和植物凝集素 (phytohemoagglutinin);例如，NK细胞可在有一种或多种选自下组的试剂存在下被活化： CD137配体蛋白，CD137抗体，化-15蛋白，比-15受体抗体，化-2蛋白，比-12蛋白，比-21蛋白 和K562细胞系）。在一【具体实施方式】中，所述宿主细胞是分离自癌症患者的自体T淋己细胞 或自体NK细胞。在一【具体实施方式】中，所述宿主细胞是同种异体T淋己细胞或同种异体NK细 胞。在一【具体实施方式】中，所述宿主细胞是抑制了或消除了内源性T细胞受体表达的同种异 体T淋己细胞。
[0016] 在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含（i)编码本文公开的任一嵌合 受体的多核巧酸或包含该多核巧酸的载体，或表达该嵌合受体的宿主细胞;和（ii)药学上 可接受的载体或赋形剂。所述药物组合物进一步可包含对癌细胞产生毒性的抗体(如与肿 瘤细胞结合并具有与人CD16结合的人或人源化Fc部分的抗体，或利妥昔单抗，或曲妥珠单 抗，或者hu 14.18K322A，或依帕珠单抗，西妥昔单抗，或拉贝珠单抗）。
[0017] 在另一方面，本发明提供了一种增强有此需要的个体中基于抗体的癌症免疫治疗 的疗效的方法。所述个体可用与癌细胞结合的抗体治疗。该方法可包括将治疗有效量的T淋 己细胞或NK细胞引入该个体，该T淋己细胞或NK细胞表达本文描述的任一嵌合受体。
[0018] 此外，本发明提供了一种增强个体中T淋己细胞或NK细胞抗体一依赖细胞毒性 (ADCC)的方法，所述方法包括将治疗有效量的T淋己细胞或NK细胞引入该个体，该T淋己细 胞或NK细胞表达本文描述的嵌合受体。在一【具体实施方式】中，所述个体正在接受与癌细胞 结合的抗体治疗。
[0019] 在本文所述的任一方法中，所述个体可用抗体治疗，该抗体具有与人CD16结合的 人或人源化Fc部分。在一【具体实施方式】中，所述个体用选自下组的抗体治疗:利妥昔单抗、 曲妥珠单抗、hul4.18K322A、依帕珠单抗、西妥昔单抗和拉贝珠单抗。在一【具体实施方式】中， 所述癌症选自下组:上皮癌、淋己瘤、肉瘤、母细胞瘤和白血病。在一【具体实施方式】中，所述 癌症选自下组:B-细胞来源的癌症(例如，B细胞急性淋己细胞白血病、B细胞慢性淋己细胞 白血病、B细胞非霍奇金淋己瘤），乳腺癌，胃癌，神经母细胞瘤，骨肉瘤，肺癌，黑色素瘤，前 列腺癌，结肠癌，肾细胞癌，卵巢癌，横纹肌肉瘤，白血病，和霍奇金氏淋己瘤。在一具体实施 方式中，所述T淋己细胞或NK细胞为从所述个体分离的自体T淋己细胞或自体NK细胞。在一
【具体实施方式】中，在引入个体之前，所述自体T淋己细胞或自体NK细胞经离体活化或扩增。 在一【具体实施方式】中，所述T淋己细胞或NK细胞为同种异体T淋己细胞或同种异体NK细胞。 在一【具体实施方式】中，所述同种异体T淋己细胞为抑制或消除了内源性T细胞受体表达的T 淋己细胞。在一【具体实施方式】中，所述同种异体T淋己细胞或同种异体NK细胞先经离体活化 和/或扩增，再引入个体。在一【具体实施方式】中，用选自下组的方法将所述嵌合受体引入T淋 己细胞或NK细胞:逆转录病毒转导，慢病毒转导，DNA电穿孔和RNA电穿孔。
[0020] 在本文所公开的任一设及T淋己细胞活化的方法中，所述T淋己细胞可在有选自下 组的一种或多种试剂存在下被活化:抗-CD3/CD28，比-2，和植物凝集素。在本文所公开的任 一设及NK细胞活化的方法中，所述NK细胞可在有选自下组的一种或多种试剂存在下被活 化:CD137配体蛋白质、CD137抗体、比-15蛋白、比-15受体抗体、比-2蛋白、比-12蛋白、比-21 蛋白和K562细胞系。
[0021 ]本文所公开的任一方法可进一步包括给个体施用治疗有效量的IL-2。
[0022] W下方面也在本发明的范围内：（i)用于增强癌症患者的ADCC效果或用于治疗癌 症的药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的编码本文所公开嵌合受体的任一多核巧 酸，包含该多核巧酸的载体，或表达所述嵌合受体的宿主细胞，和药学上可接受的载体或赋 形剂;和（ii)所述药物组合物在用于生产用于癌症治疗的药物中的应用。所述药物组合物 可进一步包含抗癌症抗体，例如本领域已知的或本文公开的。
[0023] 本发明的一个或多个实施方式在下文中详述。从如下附图和几个实施方式的具体 描述W及所附权利要求中可W明显看出本发明的其他特征或优点。
[0024] 附图简述
[0025] 本专利申请文件包含至少一幅彩色附图。只要提出请求和缴纳必要的费用，专利 局可提供附有彩色附图的本发明申请文件的副本。
[00%] 图1显示了 T细胞中CD16V-BB-C受体的表达。A.CD16V-BB-C受体构建物的示意图。 B.外周血T淋己细胞中CD 16V-BB-C受体的表达。流式细胞散点图说明在用单独包含GFP (模 拟）或包含GFP和CD16V-BB-C的载体转导的活化的T淋己细胞中CD16(B73.1抗体）与GFP或 CD3C的组合表达。在每个象限示出了阳性细胞百分比。C.用GFP单独或CD16V-BB-C转导的T 淋己细胞的细胞裂解物的蛋白质印迹。膜用抗CD3C抗体探测。
[0027] 图2显示了 T细胞亚群中CD16V-BB-C受体的表达。A.活化的CD3巧淋己细胞用单独 包含GFP的载体(模拟)和用包含CD16V-BB-C构建物的载体转导。用流式细胞仪检测CD4+和 CD8+细胞中CD 16的表达。散点图显示了典型试验的结果。B. Ξ个献血者的T淋己细胞获得的 结果概要(平均值±SD)(P = N.S.)。
[002引图3显示了CD16V-BB-C受体的抗体结合力。A.用包含GFP(模拟)或GFP和CD16V-BB- ζ的载体转导的T淋己细胞与利妥昔单抗溫育30分钟；用与藻红蛋白偶联的羊抗人IgG抗体 (GAH IgG)和流式细胞术目测观察结合于细胞表面的抗体量。B.用CD16V-BB-C(V158)或 CD16F-BB-C(F158)转导的化rkat细胞与利妥昔单抗溫育30分钟。该图比较了从表达运两个 受体的细胞获得的GFP平均巧光强度(MFI)和GAH IgG MFI之间的关系。C.在利妥昔单抗存 在下，将经模拟转导或用CD16V-BB-C转导的化rkat细胞与经巧黄绿素 AM澄红(calcein AM orange-red)标记的化udi细胞共同培养。定量测定各散点图的右上象限中的细胞聚集物。 D.C.栏所示聚集实验的概要显示了 Ξ个实验的平均值±50。在利妥昔单抗（"Ab")存在下， 用CD16V-BB-C转导的化rkat细胞测得的聚集明显更高于其他Ξ种培养条件下测得的聚集 。<0.001，采用*检测）。
[00巧]图4显示了 CD16V-BB-C和CD16F-BB-C受体对曲妥珠单抗和人IgG的相对结合力。经 CD16V-BB-C(V158，黑色符号）或CD16F-BB-C(F158，白色符号）转导的化rkat细胞与曲妥珠 单抗或人IgG溫育30分钟。该图比较了从表达任一受体的细胞中获得的GFP平均巧光强度 (MFI)和与藻红蛋白（PE)偶联的羊抗人(GAH)IgG MFI之间的关系（曲妥珠单抗和