>[0051] 如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式"一"，"一个"和"该"包括复数引 用，除非上下文另有明确说明。
[0052] 按照本发明，可采用本领域常规的分子生物学，微生物学，和重组DNA技术。运些技 术在文献中有充分解释。参见，例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，分子克隆:实验室手册， 第二版（1989)，冷泉港实验室出版社（Cold Spring化rbor LaboratoiT Press),冷泉港， 纽约（本文中，"Sambrook等，1989") ;DNA克隆：一种实用方法，卷I和II(D.N.Glover编 1985);寡核巧酸合成（Oligonucleotide Synthesis) (MJ.Gait编 1984);核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization) (B.D.化mes&S.J.Higgins编（1985〉〉；转录和翻译（Transcription and Translation) (B. D.化mes&S. J .Higgins ,编（1984〉〉；动物细胞培养（Animal Cell Qilture)(R. I.Rreshney,编（1986〉〉；固定化细胞和酶（Immobilized Cells and Enzymes) (1化出版社，（1986〉〉；B.Pe;rbal,分子克隆实践指南（A practical Guide To Molecular Cloning)(1984);F.M.Ausubel 等编，分子生物学最新方案（Current Protocols in Molecular Biology)，，约翰韦利父子股份有限公司（John Wi 1 巧&Son, Inc s)(1994)等。
[0053] 本发明的嵌合受体
[0054] 本发明提供了一种嵌合受体，其包含(a)F158 FCGR3A或V158 FCGR3A变体的胞外 配体结合区（例如，SEQIDN0:16或SEQIDN0:2，各自地）；（b)CD8α的较链区和跨膜区（例 如，SEQ ID ^:3);和山)包含4-1BB信号传导区（例如，SEQ ID N0:4)和CD3C信号传导区（例 如，SEQ ID NO:5)的胞浆区。所述嵌合受体可进一步包含CD8a的信号肤，例如，SEQ ID NO: 6。在一【具体实施方式】中，所述嵌合受体包含如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15所示的氨基酸 序列。在一实施例中，所述嵌合受体为由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列组成的CD16V-BB-C。 在另一实施例中，所述嵌合受体为由SEQ ID ^:15所示氨基酸序列组成的〔016。-88-(。
[0055] 在一实施方式中，本发明所述嵌合受体除了包含本文所描述的两个信号传导区， 良P，CD3C和4-1BB/CD137,还包含一个或多个信号传导区。在一【具体实施方式】中，一些信号传 导区融合在一起W达到加和或协同作用。有用的其他信号传导区的非限制性实施例包括来 自于 W下的部分或全部：选自 TCRC链、CD28、0X40/CD134、4-lBB/CD137、FceRIy、IC0S/ CD278、ILRB/CD122、比-2RG/CD132 和 CD40 的一个或多个。
[0056] 本发明还提供了编码W上公开的嵌合受体的多核巧酸。在一【具体实施方式】中，所 述编码V158FCGR3A变体胞外配体结合区的多核巧酸包含SEQ ID NO: 10所示的核巧酸序列。 或者，所述编码F158FCGR3A胞外区的多核巧酸包含SEQIDN0:18所示的核巧酸序列。在一
【具体实施方式】中，所述编码CD8a较链区和跨膜区的多核巧酸包含SEQ ID NO: 11所示的核巧 酸序列。在一【具体实施方式】中，所述编码4-1BB信号传导区的多核巧酸包含SEQ ID NO: 12所 示核巧酸序列。在一【具体实施方式】中，所述编码CD3C信号传导区的多核巧酸包含SEQ ID NO: 13所示的核巧酸序列。在一【具体实施方式】中，所述编码CD8a信号肤的多核巧酸包含SEQ ID NO: 14所示的核巧酸。
[0化7] 在一实施例中，所述编码CD16V-BB-C嵌合受体的多核巧酸包含SEQ ID N0:9所示 的核巧酸序列。在另一实施例中，所述编码CD16F-BB-C嵌合受体的多核巧酸包含SEQ ID NO: 17所示的核巧酸序列。
[0058] 结合所述多核巧酸，本发明还提供了包含此类多核巧酸的载体(包括运样的载体， 其中，此类多核巧酸可操作地连接于至少一个调控元件，用于表达该嵌合受体）。本发明有 用载体的非限制性实施例包括病毒载体，如逆转录病毒载体和慢病毒载体。
[0059] 在一【具体实施方式】中，此类载体还包括自杀基因。如本文所用，术语"自杀基因"是 指引起表达该自杀基因的细胞死亡的基因。所述自杀基因可W是一种基因，其赋予给予表 达该基因的细胞对某种试剂(例如，药物）的敏感性，当细胞与该试剂接触或暴露于该试剂 中时其引起细胞死亡。自杀基因为本领域已知的（参见，例如，自杀基因治疗:方法和综述 (Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews) .Springer,Carol ine J.(癌症石开究戶/f- 癌症治疗的癌症研究英国中屯、-Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research,萨顿，萨里郡，英国），Humana 出版社，2004)，包 括，例如单纯瘤疹病毒化SV)胸巧激酶(TK)基因、胞喀晚脱氨酶山7*〇31110 daminase)、嚷岭 核巧憐酸化酶、硝基还原酶和脫冬酶，如脫冬酶8。
[0060] 本发明还提供了包含如上公开的嵌合受体的宿主细胞。有用的宿主细胞的非限制 性实施例包括T淋己细胞和NK细胞，它们可W是自体的或异体的（移除了或保留了内源性T 细胞受体）.在一【具体实施方式】中，所述宿主细胞是分离自癌症患者的自体T淋己细胞。在一
【具体实施方式】中，此类自体T淋己细胞经离体活化或扩增。
[0061] 本发明的嵌合受体可通过本领域已知的任何方法引入该宿主细胞。特别有用的方 法的非限制性实施例包括逆转录病毒转导、慢病毒转导W及DNA和mRNA电穿孔。如下实施例 所证实的，mRNA电穿孔导致本发明嵌合受体在T淋己细胞中有效表达。描述逆转录病毒转导 的文献示例包括:Anderson等，美国专利号5,399,346;Mann等，Cell 33:153(1983) ;Temin 等，美国专利号 4,650,764;Temin等，美国专利号4,980,289;Markowitz等，J.Virol.62: 1120( 1988);Temin等，美国专利号5，124，263;国际专利公布号W0 95/07358，公布于1995年 3月16日，Dou曲erty等；W及Kuo等，Blood 82:845(1993)。国际专利公布号W0 95/07358描 述了原代B淋己细胞的高效转导。可采用的逆转录病毒转导和mRNA电穿孔的具体技术的实 例还可参见W下实施例部分。
[0062] 宿主细胞活化和扩增通常用于将病毒载体整合进基因组并表达编码本发明嵌合 受体的基因。然而，如果使用了mRNA电穿孔，不需要活化或扩增(虽然电穿孔在活化细胞中 更有效）。作为病毒转导的结果，宿主细胞(T淋己细胞或NKT细胞)长时间表达本发明的嵌合 受体，从而可能提供比mRNA电穿孔更强的效果，mRNA电穿孔时受体是瞬间表达的（通常3-5 天）。然而，病毒转导复杂、昂贵且难W实施，而mRNA电穿孔简单很多且更容易实施。另外，如 果存在潜在的毒性，那瞬间表达是有利的且因可能的副作用其应该在临床检测初期有用。 [006引本发明的药物组合物
[0064] 本发明的另一方面提供了药物组合物。在一实施方式中，本发明提供了药物组合 物，其包含(i)编码本发明的嵌合受体的多核巧酸或包含此类多核巧酸的载体，和（ii)药学 上可接受的载体或赋形剂。
[0065] 在另一实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含（i)包含本发明嵌合受 体的宿主细胞和（ii)药学上可接受的载体或赋形剂。在一【具体实施方式】中，该药物组合物 进一步包含能对癌症细胞产生细胞毒性的单克隆抗体（如，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、 hul4.18K322A等）或另一种包含Fc部分的抗肿瘤分子(例如，由结合肿瘤表面受体的配体 (如细胞因子、免疫细胞受体)与免疫球蛋白的Fc-部分或包含Fc的DNA或RNA构成的复合分 子)。
[0066] 用于本发明药物组合物的适宜赋形剂可W是本领域技术人员所熟知的，可，例如， 包括组织培养基（例如用于细胞离体存活）或生理盐水溶液（例如，当将细胞注射给患者 时）。药学上可接受的赋形剂的透彻讨论可在《雷明顿药学科学HRemington's Pharmaceut i ca 1 Sc i ences)(马克出版社，新泽西州1991)中获得。
[0067] 必要时，本发明药物组合物还可包含一种或多种额外的活性化合物，用于正在接 受治疗的适应症，较佳地，是具有互补作用且不负面影响彼此的活性化合物。可能的额外活 性化合物的非限制例子包括，例如，IL2W及在组合疗法的讨论中列出的各种试剂。
[00側本发明的治疗方法
[0069] 本发明的嵌合受体赋予T淋己细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)性能并增强NK细胞 中的抗体依赖性细胞毒性。当所述受体与结合于肿瘤细胞的抗体(或另一包含Fc部分的抗 肿瘤分子)接合，它会触发T细胞活化、持续扩增和该抗体(或包含化部分的此外其它抗肿瘤 分子)所祀向的癌细胞的特异性细胞毒性。如下面实施例部分公开的，包含本发明的受体的 T淋己细胞对广泛的肿瘤细胞类型具有高细胞毒性，包括B细胞淋己瘤、乳腺癌、胃癌、神经 母细胞瘤和骨肉瘤，W及原发性慢性淋己细胞性白血病(CLL)。细胞毒性完全依赖于结合于 祀细胞的特异性抗体的存在:可溶性抗体不引起裂解颗粒的胞吐并不引起非特异性细胞毒 性。CD 16与Ig的化部分的亲和力是ADCC进而对抗体免疫治疗的临床反应的关键决定因素。 具有158V多态性的CD 16选为例子;该变体对Ig具有高亲和力且介导优越的ADCC。
[0070] 由于一种受体能够用于多种癌症细胞类型，本发明的嵌合体受体促进T细胞疗法。 它还允许同时祀向多种抗原，考虑到肿瘤利用的免疫逃脱机制，该策略最终可能有利 (Gru卵等，N.Engl. J.Med. 2013;368(16) :1509-1518)。无论何时需要，通过简单停止施用抗 体，可停止抗体导向的细胞毒性。因为表达本发明嵌合受体的T细胞只被结合于祀细胞的抗 体激活，未结合的免疫球蛋白对注入的T细胞不应有任何刺激。通过使用mRNA电穿孔W瞬时 表达嵌合受体W限制任何潜在的自体免疫反应性，可W进一步提高临床安全性。
[0071] 下面在实施例部分中披露的结果表明自体T细胞的注入（用本发明嵌合受体作基 因修饰后经离体活化和扩增W及重新注入)应该显著促进ADCC。因为组合的CD3C/4-1BB信 号传导也引起T细胞增殖，在肿瘤部位应该有活化T细胞的积累，可能进一步增强它们的活 性。
[0072] 因此，在一实施方式中，本发明提供用于提高有此需要的个体中癌症的基于抗体 免疫疗法的疗效的方法，所述个体正在接受抗体的治疗，该抗体可W结合于癌细胞并具有 可结合于人CD16的人源化化部分，所述方法包括往所述个体中引入治疗有效量的T淋己细 胞或NK细胞，该T淋己细胞或NK细胞包含本发明的嵌合受体。
[0073] 在另一实施方式中，本发明提供了提高个体中T淋己细胞或NK细胞ADCC活性的方 法，包括给所述个体施用T淋己细胞或NK细胞，该T淋己细胞或NK细胞包含本发明的嵌合受 体。在一实施方式中，所述个体患有癌症。在一【具体实施方式】中，该个体正在接受能结合癌 细胞的抗体治疗。
[0074] 在上述方法的一实施方式中，所述T淋己细胞或NK细胞是分离自个体的自体T淋己 细胞或NK细胞。在一特定实施方式中，在重新引入个体之前，所述自体的T淋己细胞或NK细 胞离体活化和/或扩增。在另一实施方式中，T淋己细胞或NK细胞是同种异体T淋己细胞或NK 细胞。在一【具体实施方式】中，T淋己细胞是同种异体T淋己细胞，其中内源性T细胞受体的表 达被抑制或消除。在一【具体实施方式】中，在引入个体之前，同种异体T淋己细胞离体活化和/ 或扩增。T淋己细胞可W用本领域任何已知的方法活化，例如，在抗-CD3/CD28、比-2和/或植 物凝集素存在下。NK细胞可W用本领域任何已知的方法活化，例如，在一个或多个选自下组 的试剂存在下：CD 137配体蛋白、CD 137抗体、化-15蛋白、比-15受体抗体、化-2蛋白、比-12 蛋白、化-21蛋白和K562细胞系。参见，例如，美国专利号7，435，596和8，026，097中描述的扩 增Μ细胞的有用方法。
[0075] 在上述方法的一实施方式中，通过逆转录病毒转导、慢病毒转导或DNA或RNA电穿 孔将所述嵌合受体引入Τ淋己细胞或ΝΚ细胞(例如，在离体活化和/或扩增后）。
[0076] 在上述方法的一实施方式中，将Τ淋己细胞或ΝΚ细胞引入(或重新引入)个体中，然 后给个体施用治疗有效量的IL-2。
[0077] 本发明的嵌合受体可用于治疗任何癌症，包括但不限于，腺癌、淋己瘤、肉瘤、母细 胞瘤和白血病，对于运些疾病，存在或能产生具有与CD16结合的Fc部分的特异性抗体。可W 用本发明的嵌合受体治疗的癌症的具体非限制性例子包括，例如，B细胞来源的癌症(例如， B系急性淋己细胞性白血病、B细胞慢性淋己细胞性白血病和B细胞非霍奇金淋己瘤）、乳腺 癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤。
[0078] 可通过本发明方法提高其疗效并包含可结合人CD16的抗癌抗体的非限制性例子 包括，例如，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、hul4.18K322A、依帕珠单抗、西妥昔单抗和拉贝珠单 抗（Labetuzumab)。
[0079] 所用抗体的适当剂量将取决于要治疗的癌症类型、疾病的严重程度和病程、之前 的治疗方法、病人的临床病史及对抗体的反应和主治医生的判断。可W-次性或通过一系 列的治疗向病人施用所述抗体。可W简单地通过传统的技术及试验监测本发明所述治疗的 进展。
[0080] 可W用任何合适的路线施用抗体，包括，全身用药W及向疾病部位(例如，对原发 性肿瘤)直接施用。
[0081] 本发明所述方法中使用的T淋己细胞最好是病人自己的细胞（即，自体细胞），运些 细胞早先用标准方法从血液样本中分离且优选经离体活化和扩增(例如，3-5天），例如，抗- CD3/CD28珠、化-2或植物凝集素等。或者，可W使用同种异体T淋己细胞(较佳地，其中内源 性了细胞受体的表达被抑制或消除的同种异体1'淋己细胞）。560 1'〇'11?11等，81〇〇(1，2〇12 119:5697-5705。分离后(和任选的活化和/或扩增），来自病人的T淋己细胞及NK细胞用编码 本发明嵌合受体的多核巧酸(或包含此类多核巧酸的载体)转导，从而所述嵌合受体在T细 胞或NK细胞的细胞表面表达。然后被修饰的细胞可施用于患者(例如，治疗性抗体注入后1 天)。
[0082] 根据本发明，患者可W通过输注治疗有效剂量(在每公斤体重约105至l〇w的范围 内或更多的细胞(细胞/千克））的包含本发明嵌合受体的T淋己细胞或NK细胞来治疗。只要 患者可W耐受，可W经常或多次重复输注直至达到所需的反应。病人不同，适宜的输注剂量 和安排也不同，但可W由主治医生为特定病人决定。通常情况下，会输注大约1〇6细胞/Kg的 初始剂量，逐步上升到1〇8或更多细胞/Kg。输注后可W共同施用IL-2来扩增输注的细胞。 IL-2的量可为约1-5X 106国际单位每平方米身体表面积。
[0083] 本发明所述方法中使用的NK细胞可通过暴露于细胞优先扩增，该细胞缺乏主要组 织相容性复合物I和/或II分子或表达不佳W及已经被基因修饰W表