4)，该剂量是在甘油引起的横纹肌溶解模型中具有活性的剂量(图2)。
[0197] 在狗中，在3mg/kg p. 〇.时，化合物A是非淋巴细胞减少性的（图5A)。在狗中，这种 非淋巴细胞减少性剂量已经提供了接触量(Cmax和AUC)，这种接触量超过在大鼠中充分AKI 保护作用所需要的接触量(3mg/kg)(表4)。在狗中，在10和30mg/kg p.o.的高剂量下，化合 物A只引起短暂的淋巴细胞减少（图5A)。与此相反，3mg/kg p.o.的BAF-312引起淋巴细胞的 极度（Imax，~80% )降低，这需要至少60天才能恢复（图5B)。
[0198] 化合物A是独特的SlP1激动剂，因为它在非淋巴细胞减少性剂量下第一次显示出 了强烈的AKI保护作用（图3D)。虽然其它SlP 1化合物(例如芬戈莫德和SEW2871)在AKI模型 中也具有活性，但它们只在淋巴细胞减少性剂量下才有效果(Awad等人2006，Am J Physiol Renal Physiol 290:F1516-F1524;Sanna等人2004，JBC 279:13839-13848;Lai等人2007, Kidney Int 71:1223-1231)〇
[0199] 这些体内数据证明，化合物A可用作在非淋巴细胞减少性剂量下产生AKI保护作用 的SlP1激动剂。化合物A尤其不同于本文描述的BAF-312,以及特别用于淋巴细胞减少性药 剂(例如，用于自身免疫疾病)的其它SlPCi能性拮抗剂。
[0200] 4-内皮屏障完整性的分化
[0201] SlPdi能性拮抗作用与内皮破坏作用有关。在用芬戈莫德治疗的多发性硬化患者 中，黄斑和肺水肿是突出的不利状况(Jain and Bhatti ,2012,巧:672-680)。
[0202]我们发现，长期口服给予健康小鼠芬戈莫德，能够产生显著的血管渗漏（图6A、 6B)，这与临床发现一致。在1和3mg/kg b. i . d.时，选择性的SlPdfi动剂BAF-312甚至在肺中 引起更大的血管渗漏（图6A、6B)。这些发现与先前的报道相符，先前的报道指出，在肺中， SlP 1功能性拮抗剂改变内皮屏障完整性，并且促进血管蛋白溢出（Shea等人2010，Am J Respir Cell Mol 8丨〇1|^:662-673)。与此相反，化合物4没有增加血管渗漏(在3和1〇11^/1^ 时，在小鼠中提供充分的AKI保护作用的代表性剂量）（图6A、6B)。类似地，在Fisher大鼠中， 在1和3mg/kg(代表AKI有效剂量)或甚至更高剂量（10mg/kg)时，化合物A没有引起肺血管渗 漏。与此相反，在3mg/kg(无效的AKI剂量）以及30mg/kg(部分有效的AKI剂量)时，BAF-312引 起大鼠的血管渗漏。
[0203]考虑到所观察到的BAF-312的内皮损伤性能（图6)，BAF-312的保护性能可以被它 的内皮有害影响抵消，产生所观察到的部分保护作用（图1B)。内皮损伤是许多SlP1功能性 拮抗剂的显著特征（图6和公开的数据）。因此，在内皮保护性剂量而不是内皮损伤剂量下， 化合物A的新的特性提供了防止急性肾损伤的机会。
[0204] 5-体外药理学
[0205]化合物A显示为有效的SlP1激动剂。在过表达人类SlPj^CHO细胞中(G-融合），钙动 员试验中的EC5q值是3InM，β-抑制蛋白试验中的EC5q值是656nM，GTP γ S试验中的EC5q值是 206ηΜ，内化作用试验中的EC5Q值是213ηΜ(表1)。
[0206]表1:使用各种体外试验的化合物A、BAF-312和芬戈莫德的EC50值
[0207] 为了过表达人类SlP1，设计Chem*和CHO细胞。HUVEC内源性表达SlP1 ^ChemiScreen 试验。是指未测定。
[0208] *值是2个独立实验的平均值。β-抑制蛋白试验：Cpd A-800&511、BAF-312-7 · 9& 2 · 83、S1P-41&20 · 8;内在化试验：Cpd A-160&266、BAF-312-〈0 · 5&0 · 67、芬戈莫德-P-O · 7& 4.74、S1P-56&40.2〇
[0211]化合物A没有显示出功能性的拮抗性能，也没有引起受体灵敏度降低（图7-10)。在 四个独立的体外系统中表明了这种差异，其中两个系统使用在内皮细胞HDMEC(人类表皮微 血管内皮细胞)和HUVEC(人类脐静脉内皮细胞）中进行的阻抗测量，两个系统使用在CHO细 胞和HSC细胞(肝脏星形细胞）中进行的FlipR试验。用化合物A预先培养(而后是洗涤步骤）， 用SlP(图7-9)或化合物A(图10)几乎完成了第二次刺激。然而，用功能性拮抗剂预先培养， 阻碍了用SlP(图7-9)或BAF-312(图10)进行充分的第二次刺激。在HUVEC阻抗试验中，将每 个化合物开始钝化SlP 1引起的阻抗响应时的浓度与该试验的绝对EC5q值进行比较。BAF-312 在5x EC5q值时开始灵敏度降低，SEW2871在20x EC5q值时开始灵敏度降低，而对于化合物A， 在高达60x EC5q值时仍然没有观察到灵敏度降低。
[0212] 图7-10中的数据表明，功能性诘抗剂（芬戈莫德、BAF-312、SEW2871和ponesimod) 引起持续的受体灵敏度降低。
[0213]相比于BAF-312或芬戈莫德，化合物A对SlP1信号途径显示了不同的相对效能（表 1)。就蛋白而言，由于试验之间的试验条件不同，通过在CHO试验中对于cAMP、i3抑制蛋白和 内在化的效能进行比较(使用相同培养基条件），我们排除了蛋白结合对相对效能的可能影 响。如表2所示，相比于内在化或β-抑制蛋白，化合物A (相对于BAF-312和SIP)更偏向于cAMP 的活化。
[0214] 表2:化合物A、BAF-312和SlP的相对EC5Q值(相对于cAMP试验进行校正）。在3个试验 中，培养基含有相同的蛋白浓度(〇.5%FBS)
L〇216」在人类肾小管上皮细胞(RPTEC)中，化合物A以浓度依赖性方式产生存活标志pERK 和pAKt，在基础条件下的EC5q值为大约3μΜ，或在衣霉素损伤之后，EC5q值为大约ΙΟμΜ。这种 促存活效果在血清饥饿之后的人类内皮细胞中更有效，对于P-Akt，EC 5Q值为ΙΟΙηΜ，对于P-ERKv2JC5q值为190nM。此外，在通过半胱天冬酶3/7活性评价的RPTEC中，化合物A抑制衣霉 素引起的细胞程序死亡，EC 5q值为大约3-10μΜ。
[0217] 对于三个人类内皮细胞类型（HPAEC、HUVEC和HRGEC )，不同于BAF-312，化合物A使 TNFa引起的粘附分子(包括I CAM-1、VCAM-1和Ρ/Ε选择蛋白）的过表达降低。已知的是，在AKI 患者的血衆样品中，这些内皮功能障碍标志被上调（Sadik等人2012，M〇1 Cell Biochem ^:73-81)，并且参与炎性细胞进入到肾小管间质空间中的渗透过程。
[0218] 化合物A对于SlPR家族中的其它受体(表3)、CEREP中的110个以上的靶向、超过216 种激酶和离子通道中的5个以上的靶向具有诱人的选择特性。如表3所示，相比于芬戈莫德， 化合物A是更具选择性的SlP1激动剂。对SlP2和SlP3缺乏活性是特别重要的，因为，据报道， 这些受体对抗一^:在内皮细胞上的功能。
[0219]表3:化合物A、BAF_312和芬戈莫德针对鞘氨醇受体家族成员的选择性
[0221] 是指未测定。
[0222] 化合物A对一些信号途径（例如cAMP)的优先活化，同时对其它途径(例如内在化、 β-抑制蛋白）的效能较弱，提供了 AKI所需要的特性（即，受体灵敏度降低最小、没有持续的 淋巴细胞减少状况、内皮保护作用）。这与SlP1功能性拮抗剂BAF-312和芬戈莫德在多发性 硬化中的表现形成对比（高受体灵敏度降低、强烈的淋巴细胞减少-内皮损伤是不希望有的 副作用）。这种特性明确说明了化合物A可作为新类别的偏向SlP 1的激动剂。
[0223] 表4: 3mg/kg ρ. 〇.的化合物A在雄性Fisher大鼠和比格猎犬中的药物动力学性能
[0225] 结论
[0226] 这些临床前数据表明，化合物A对于AKI的许多机制终点具有极大的影响，包括：明 显保持内皮屏障功能，以及降低肾小管坏死和巨噬细胞炎症。化合物A的所有AKI保护性剂 量(在小鼠和大鼠中）是非淋巴细胞减少性剂量，并且当在狗中达到相应的接触量时，化合 物A仍然是非淋巴细胞减少性的。由于化合物A在所有AKI保护性剂量下是非淋巴细胞减少 性的，所以，它的AKI保护作用的机理与淋巴细胞减少无关。化合物A对于内皮和上皮细胞具 有直接保护作用，这可能是其在AKI中的作用机理。
[0227] 这与具有不同信号特性的SlP1化合物存在的状况形成对比，并且是：DSlP1功能性 拮抗剂，ii)内皮损伤，以及iii)在淋巴细胞减少性剂量下，在I/R引起的AKI中只具有有限 的活性。
[0228]化合物A为治疗AKI患者提供了新机会，不会引起淋巴细胞减少，并由此避免了相 应的副作用(包括感染）。因此，在目前对患者没有合适药物的领域中，该化合物具有改变治 疗的潜力。
【主权项】
1. {4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5，4-d]嘧啶-2-基]-2，6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其 可药用盐，其用于预防或治疗AKI (急性肾损伤）。2. 根据权利要求1的用途的{4-[5-(3_氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-(1]嘧啶-2-基]-2,6-二 甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐，其中{4-[5-(3_氯-苯氧基）-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸当以AKI保护性剂量给予时不会引起淋巴细胞减少，并且当 给予较高剂量时，引起有限的淋巴细胞减少。3. 根据权利要求1或2的用途的{4-[5-(3_氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2， 6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐，其用作非淋巴细胞减少性药剂。4. 根据权利要求1或2的用途的{4-[5-(3_氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2， 6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐，其中当以AKI保护性剂量给予时，它没有淋巴细胞 减少性效果。5. 根据权利要求1的用途的{4-[5-(3_氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-(1]嘧啶-2-基]-2,6-二 甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐，其中，{4-[5-(3_氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸当以非淋巴细胞减少性剂量给予时是AKI保护性的。6. {4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5，4-d]嘧啶-2-基]-2，6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其 可药用盐，其用于预防或治疗AKI(急性肾损伤），其中，{4-[5-(3_氯-苯氧基)-噁唑并[5,4_ d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸是不会引起受体灵敏度降低的选择性的SIPji 动剂。7. {4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5，4-d]嘧啶-2-基]-2，6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其 可药用盐，其在预防或治疗AKI中没有产生淋巴细胞减少的效果。8. 含有{4- [ 5- (3-氯-苯氧基)-噁唑并[5，4-d ]嘧啶-2-基]-2，6-二甲基-苯氧基}-乙酸 或其可药用盐作为活性成分的药物。9. 药物组合物，其含有作为活性成分的根据权利要求1至7的任一项的用途的{4-[5_ (3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐，以 及药用赋形剂。10. 在需要的患者中治疗AKI的方法，所述方法包括：给予所述患者治疗有效量的{4-[5-( 3-氯-苯氧基)-噁唑并[5，4-d ]嘧啶-2-基]-2，6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐。11. 根据权利要求10的方法，其中，治疗是预防性的。12. -种制品，其包括： -包装材料； -药物组合物，所述药物组合物含有作为活性成分的{4-[5-(3_氯-苯氧基)-噁唑并[5， 4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐，以及药用赋形剂;和 -包含在包装材料内的标签或包装说明书，用于注明：可以用该药物组合物治疗AKI患 者。13. 根据权利要求12的制品，其中，包含在包装材料内的标签或包装说明书注明：可以 用上述药物组合物治疗AKI患者，不会产生淋巴细胞减少性效果。14. 根据权利要求12或13的制品，其中，所述治疗是预防性的。
【专利摘要】用于预防或治疗AKI(急性肾损伤)的{4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐。药物和其药物组合物。
【IPC分类】A61K31/519, A61P13/12
【公开号】CN105658220
【申请号】
【发明人】V·白里安, S·格拉策, T·许布希勒, P·雅尼亚克, D·卡德赖特, A·帕卡尔, B·波里尔, M·谢弗, P·沃尔法特
【申请人】赛诺菲
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年10月15日