er473，Cst#9271 )和抗磷酸Erkl/2 (ph〇pSh〇-Tyr202/Tyr204，CstM377)检验硝化纤维膜。对膜进行光密度分析之后，抗€(-Tubul ine( Cs t#2144)标记的Tubuline 用于归一化。
[0168] g)在HUVEC细胞试验中的Akt和ERKv2磷酸化(在饥饿条件下）
[0169] 将HUVEC细胞(Lonza)播种在白色6孔多孔板中的完全EGM2培养基(Lonza)中24小 时，每孔0.3xl0 6个细胞，每孔2mL。在900yL静态培养基中，用血清使细胞额外饥饿24小时。 在37°C，在IOOyL体积下，将高浓度的化合物A、BAF-312或芬戈莫德（IOX)加入到每个孔中， 保持10分钟。除去培养基之后，用冷的PBS冲洗细胞，并将细胞在冰上、在含有l%triton、蛋 白酶和磷酸酶抑制剂的冷的IOOyL RIPA缓冲液中溶解。为了进行蛋白质印迹，将30yg总蛋 白溶解产物装填到4-12%bis-tris凝胶（Invitrogen)中。在迀移和转移之后，用抗磷酸Akt (Phospho_Ser473，Cst#2965)和抗磷酸 Erki/2(phopsho_Tyr202/Tyr204，Cst#4377)检验硝 化纤维膜。对膜进行光密度分析之后，抗a-Tubuline(Cst#2144)标记的Tubuline用于归一 化。
[0170] h)衣霉素引起的细胞程序死亡试验
[0171] 利用Caspase-Glo 3/7试验试剂盒（Promega)的方法，在RPTEC中，测定化合物A对 衣霉素(TN)引起的细胞程序死亡的影响。简要地说，将RPTEC细胞(Lonza)播种在白色96孔 多孔板中的REGM(REBM培养基加上0.5 %FCS加上Singlequots，Lonza)培养基中，每孔 30xl03个细胞，并附着24小时。24小时之后，用血清和不含补充物的培养基替换完全培养基 (56yL/孔）。将细胞用化合物A(最终浓度0.3-30μΜ，7yL)预先处理30分钟，而后加入衣霉素 (TN，最终浓度0. lyg/mL，7yL)。在37 °C、5 %⑶2条件下保持24小时之后，加入半胱天冬酶-Glo试剂，并在摇动下将培养板放置1小时。用Envision读数器(Perkin Elmer)的方法，记录 荧光。结果用TN引起的细胞程序死亡的百分比抑制来表示。
[0172] i )TNFa引起的粘附分子的过表达试验
[0173] 利用ELISA，在HUVEC中，测定扣厶1-1、￥0厶1-1和?/^-选择蛋白表达。在10(^1^的体积 下，将HUVEC细胞播种在96孔多孔板中的EGM2培养基(Lonza)中，每孔25xl0 3个细胞，并附着 24小时。24小时之后，用静态培养基(不含补充物和血清的EGM2)替换完全培养基，保持3小 时.随后，将细胞用化合物A或BAF-312(l-30yM)预先处理18小时。然后，在不含生长因子的 培养基中，将细胞用TNF-α(3ng/mL)再处理6小时。除去培养基，洗涤细胞，并且在4°C，每个 孔用IOOyL RLC2溶液(Alphelys#01-RLC2-RTU30)固定20分钟。将固定的细胞用IOOyL HBSS 洗涤两次，而后加入抗体抗ICAM-I (#BBA3，R&D System)、抗VCAM-I (#BBA5，R&D System)和 抗P/E-选择蛋白，R&D system)，保持I小时。彻底洗涤之后，加入抗小鼠 IgG HRP(# NA931，Amersham)，保持2小时。洗涤并加入HRP底物（〇ro，Sigma#P9187)之后，读取450nm (Envision)下的光密度。结果用TNF-α引起的粘附分子表达的百分比抑制来表示。
[0174] j)利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和内皮细胞进行阻抗测定试验
[0175] I. CHO 细胞
[0176] 源于CEREP的阻抗试验用于测定化合物A、BAF-312和芬戈莫德对SlPj^EC5O活性。
[0177] 2.内皮细胞
[0178] 浓度依赖性检验化合物A、BAF-312、芬戈莫德、SEW2871和SIP (用作阳性对照)对形 变的影响，利用电阻抗(X-celligence system)的变化检测这种形变，监测SlPi受体在人类 表皮微血管内皮细胞(HDMEC)和人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)上的灵敏度降低状况。在第1 天，将原初细胞播种到预先涂有胶原-I的96孔E-板中，每孔20,000个细胞。粘附并繁殖24小 时之后，用SlP(IyM)、化合物A(对于HDMEC: ΙμΜ;对于HUVEC:0 · I、1、ΙΟμΜ)、BAF-312(只在 HUVEC中，I、10、IOOnM)、芬戈莫德（对于HDMEC: IOOnM;对于HUVEC: I、10、IOOnM)或SEW2871 (只在HUVEC中，0 · I、1、10μΜ)第一次刺激HDMEC和HUVEC 1小时。用SlPR激动剂培养之后，将 细胞用培养基小心地洗涤两次，而后恢复5.5小时。然后，使用增加浓度31?(0.1、1和1(^1〇 进行第二次刺激，评价前面第一次刺激对受体灵敏度降低的影响，并测定所得的阻抗。至少 一式三份地进行所有测定。在HDMEC中，所有第一次刺激的浓度大于EC 9Q。结果用平均值+/-s. e .m形式的随机阻抗单位来表示。
[0179] 5.体内药理学
[0180] a)肾脏缺血再灌注(I/R)损伤的大鼠模型
[0181] 在肾脏缺血之前一个小时，使雄性Fischer大鼠（η = 3-9,250至300g) (Charles River Laboratory ,France) 口 服接受化合物A(0 · 3、1和3mg/kg)或BAF_312(3、10和30mg/ kg)或载体(0.6%甲基纤维素-0.5%tween 80,在水中），给药体积在2mL/kg之内。在第二组 实验中，b. i . d.给予5天化合物A，评价潜在的快速减敏性。简要地说，在戊巴比妥(50mg/kg， i.P.)麻醉下，对动物进行假手术（即，剖腹手术，肾动脉分离)或进行25分钟双侧肾动脉封 闭。为了使手术过程标准化并限制个体差异，小心地监测体温(37°C_38°C)和水化状况(腹 膜注射生理血清）。在缺血时间结束时，除去夹钳，使肾脏再灌注，并控制再灌注的特性，而 后缝合肌肉和皮肤(将再灌注差的动物立即排除）。二十四小时后，采集血液和肾脏。将血液 离心（3000g，10分钟），将肝素化血浆冷冻，并使用生物化学分析器(P400，Horiba，France) 评价肌酸酐。将一个肾冷冻，进行W e s t e r η印迹分析，评价组织白蛋白（抗白蛋白，S a n t a Cruz)和组织HSP70(单克隆抗HSP70抗体，从Santa Cruz获得，#SC32239)，将第二个肾固定 (10%中性-缓冲的福尔马林)并用石蜡包埋，在5?m厚切片上进行组织分析(急性肾小管坏 死定量，使用传统的苏木精-真曙红-Saff ran，改进的Masson's三色(trichrome)和过碘酸-希夫氏相关的阿新蓝(blue alcine))和免疫组织化学分析(用单克隆抗⑶68抗体染色的巨 噬细胞，从Acris获得，#BM4000，用单克隆抗PECAM抗体染色的毛细管，从Santa Cruz获得，# SC1506,使用Ventana robot，VMS Inc·)。用肾皮质延髓区域的12-15区域中所呈现出的细 胞坏死的肾小管的百分比来表示急性肾小管坏死。用正图像数(Aperio算法）占全部的百分 比来表示⑶68和PECAM免疫标记。血浆肌酸酐用平均值+/-S. e. m来表示。
[0182] b)横纹肌溶解引起的肾损伤的小鼠模型
[0183] 在注射甘油之前一个小时，使Swi ss (CDl)雄性小鼠（η = 5-15, 13-14周大） (Charles River Laboratory，France) 口 服接受化合物Α(0 · 3、1、3和10mg/kg)或载体 (0.6%甲基纤维素-0 · 5%tween 80,在水中），给药体积在10mL/kg之内。在戊巴比妥(33mg/ kg)和氯胺酮(40mg/kg)麻醉下，将8mL/kg的甘油（50%v/v，在PBS中）或载体(PBS)肌内注射 到后肢中（每个腿、腓肠肌和股直肌注射2次）。二十四小时后，采集血液，离心（3000g，10分 钟），将肝素化血浆冷冻，并使用生物化学分析器(P400，H〇riba，FranCe)评价肌酸酐。结果 用平均值+/-S. e .m来表示。
[0184] 结果
[0185] 为了证明按照本发明的化合物（即化合物A)在AKI环境下的活性和它相对于SlP1 功能性拮抗剂的差异，对其进行各种体外和体内实验。
[0186] 1-心血管功能安全性
[0187] 虽然化合物A是没有功能性拮抗作用的SlP1激动剂，但是，潜在的靶向可能与SlP1 功能性拮抗剂相似。迄今为止，对于S1PV3/4/5化合物、芬戈莫德的混合物，已经获得了最多 的临床经验，它引起房室阻滞和心动过缓（Schmouder等人2006，J Clin Pharmacol 46: 895-904)。还有很多临床前的证据，证明SlP3涉及这些心脏毒性，由此，为了克服这些限制， 该领域已经开始鉴定选择性的SlP 1化合物。然而，进入到临床阶段的选择性的SlPH^合物似 乎也引起心动过缓(Gergely等人2012，BJP 167:1035-1047)，但目前它们对房室阻滞的影 响还是未知的。由此，为了评价化合物A的潜在心脏中毒，除了常规研究之外，还进行了许多 研究。在hERG试验中，化合物A的IC 5q值大于30μΜ。在兔浦肯野纤维试验中，0.3至ΙΟμΜ的试验 化合物没有显著的影响，不过，在26μΜ时观察到作用电位减小。
[0188] 在狗遥测研究中，在30或100mg/kg ρ.ο.和10或30mg/kg i.v.(输液30分钟）时，没 有观察到对心率或房室传导阻滞或任何其它ECG参数的影响。在两个剂量下，血压没有显著 变化。
[0189] 2-体内肾脏药理学
[0190] 肾脏缺血再灌注（I/R)损伤的大鼠模型用于模拟患者进行心脏手术之后引起的肾 脏损伤。在该模型中，化合物A显著地降低(85-90% )AKI的严重程度，这可以通过限制血清 肌酸酐（临床上有效的生物标志）的升高而得到反映（图IA代表5个独立的研究）。影响是剂 量依赖性的，并且在1和3mg/kg p. 〇 .时是统计上显著的（图1A)。组织分析表明，化合物A通 过防止白蛋白溢出（图1C)和保护毛细管而对血管系统具有直接影响。化合物A还防止肾脏 近端小管坏死、降低巨噬细胞渗透和升高肾脏HSP70蛋白（与肾脏缺血性损伤之后的修复相 关的标志）。化合物A没有显示快速减敏的迹象，相比于单一给药，在重复BID给药5天之后仍 然保持相似的活性(图1D)。
[0191] 在患者中，横纹肌溶解是AKI的另一种显著的病因，并且通过肌内注射甘油而在小 鼠中再现。甘油引起渐进性的肌肉损伤，同时释放肌红蛋白，随后产生肾脏功能障碍。正如 在I/R模型中所观察到的那样，在该模型中，化合物A防止显著的（在10mg/kg ρ.ο时，~ 85% )和剂量依赖的肾脏功能恶化(η = 3个独立的研究）（图2)。
[0192] 在肾脏缺血再灌注模型中，化合物A的影响类似于SlP1-选择性功能性拮抗剂MF-312的影响。在体外试验(包括内皮试验，参见表1)中，BAF-312对于大部分SlP 1的效果至少 为10倍以上，并且在大鼠中具有与化合物A相似的血浆/肾接触量。然而，尽管BAF-312的效 能/接触性能提高，但是，在缺血再灌注模型中，它没有使血清肌酸酐降低40%以上，即使在 高达30mg/kg ρ·ο·的剂量下（图1Β)。
[0193] 3-淋巴细胞减少性活性的分化
[0194] 通过SlP1活化SlP决定着淋巴细胞从淋巴结流出到血液中。这种SlP 1活化引起受体 内化作用，而后受体再循环回到细胞表面，进行重新活化。然而，SlP1功能性拮抗剂(芬戈莫 德、BAF-312)引起内化SlP1的降解，由此导致细胞表面SlP1的显著和持续减少。因此，正如临 床前和临床上所观察到的那样，SIP i功能性拮抗剂使血液淋巴细胞大量和持续减少。 (Mandala等人2〇〇2，Science 296:346-349 ;Gergely等人2012 ,BJP 167: IO35-HM7)。
[0195] 果然，在大鼠中，BAF-312引起极度（~80 % )和持续的淋巴细胞减少（图3A、3B)。这 种状况即使在剂量低到lmg/kg p.〇.(最低检验剂量)时也很明显。在大鼠AKI模型中部分有 效的2个剂量是高剂量（10和30mg/kg p. 〇.，图1B)，并且代表高度淋巴细胞减少性剂量。与 此相反，1和3mg/kg p.o.的化合物A没有显示出淋巴细胞降低状况，即使在大鼠中重复BID 给药（3mg/kg p.〇)5天之后（图3C)。高剂量的化合物A显示出剂量依赖性淋巴细胞减少状 况，但是，这些剂量代表比充分AKI保护作用所需要剂量更高的剂量。
[0196] 类似地，在3和10mg/kg时，没有在小鼠中观察到化合物A的淋巴细胞减少性活性 (图