57B16/J小鼠（η = 5-8，25-30g) (Charles River Laboratory，France)，口服给药，每天两次，给药体积在10mL/kg之内，给 药7天。每个组所包括的小鼠数目在5和8个之间。7天之后，使用氯胺酮（100mg/kg)和甲苯噻 嗪(xylasine) (10mg/kg)的i ·ρ·注射剂的混合物，使小鼠麻醉。将15mg/kg(lmL/kg)的Evans 蓝i.v.注射到颈静脉中。十分钟以后，通过左心室注射生理血清，冲洗残留的血管内的 Evans蓝。采集肺组织，称重，而后浸于纯的甲酰胺溶液中24小时，提取组织中的Evans蓝，因 此评价血管通透性。使用标准曲线，评价630nM下的Evans蓝浓度，并用肺重量进行归一化。 结果用平均值+/-S. e .m来表示。
[0133] b)大鼠肺血管渗漏研究
[0134] 用化合物 A(l、3、10、30 和10011^/1^)、8厶卩-312(0.03、0.1、0.3、3和3011^/1^)或载体 (0 · 6 %甲基纤维素-0 · 5 % tween 80，在水中）治疗雄性Fischer大鼠 （η = 4-8，280-350g) (Charles River Laboratory ,France)，口服给药，每天两次，给药体积在2mL/kg之内，给药 7天。7天之后，使用戊巴比妥(50mg/kg)的i .p.注射剂，使大鼠麻醉。将30mg/kg(lmL/kg)的 Evans蓝i.v.注射到眼眶后的静脉窦中。十五分钟以后，通过左心室注射生理血清，冲洗残 留的血管内的Evans蓝。采集肺组织，称重，而后浸于纯的甲酰胺溶液(4mL/g组织重量）中24 小时，提取组织中的Evans蓝，评价血管通透性。使用标准曲线，评价630nM下的Evans蓝浓 度。结果用平均值+/-S. e. m来表示。
[0135] 3.淋巴细胞减少性活性的分化
[0136] a)大鼠淋巴细胞减少研究
[0137] 使雄性 Sprague-Dawley 大鼠（n = 8,250 至 350g) (Charles River Laboratory, France) 口服接受3mg/kg的化合物A、BAF_312或载体(0 · 6 %甲基纤维素-〇 · 5 % tween 80，在 水中），给药体积在2mL/kg之内。使用两个方案:在5个连续日期间，单一给药或重复b. i . d. 给药。在给予化合物之后2、6和24小时(重复方案的最后一次给药），采集血液，进行血液分 析，测定全血淋巴细胞数。结果用平均值+/-s.e.m来表示。
[0138] 使雄性 Fischer 大鼠（n = 8,250 至 350g)(Charles River Laboratory, France)单 一口服接受化合物A(l、3、10和30mg/kg)、BAF-312(l和lOmg/kg)或载体(0.6%甲基纤维素-0.5 % tween 80，在水中），给药体积在2mL/kg之内。在给予化合物之后2、6和24小时，采集血 液，进行血液分析，测定全血淋巴细胞数。结果用平均值+/-s.e.m来表示。
[0139] b)小鼠淋巴细胞减少研究
[0140] 使雄性C57B16/J小鼠（n = 8,25_30g) (Charles River Laboratory ,France)单一 口服接受化合物A(1、3、10和30mg/kg)或载体(0 · 6 %甲基纤维素-0 · 5 % tween80，在水中）， 给药体积在lOmL/kg之内。在给予化合物之后2、6和24小时，采集血液，进行血液分析，测定 全血淋巴细胞数。结果用平均值+/-s.e.m来表示。
[0141] c)狗淋巴细胞减少研究
[0142] 按照剂量升高研究设计，使有意识的自由活动的公犬(Marshall Farms，n = 8， 10.5至14.3kg体重)接受口服剂量的阴性对照物（即，0.5% (w/w)羟乙基纤维素/0.6% (w/ w)聚山梨酸酯80的水溶液)或化合物A(3、10和30mg/kg)或BAF-312(10mg/kg)(阴性对照物 中的悬浮液形式），在每次给药（5mL/kg)之间，廓清时间至少为7天。对于两个化合物，在 0.5、1、2、3、4、5、6、24、48和168小时(对于BAF-312，至多66天），采集血液，进行血液分析，测 定全血淋巴细胞数。结果用平均值+/-S. e .m来表示。
[0143] 4.体外药理学
[0144] a)利用中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、Chem细胞和HSC进行钙动员(FI ipR)试验
[0145] I. CHO 细胞
[0146] 在CHO细胞(专卖品）中，在Flp-稳定转染物(带有IiSlP1-G-融合构建物)上检验化 合物A、BAF-312和芬戈莫德的活性，并检验对于hSlP2-和hSlP3-G-融合构建物(专卖品）的 选择性。W02011/086079描述了细胞株形成方法。
[0147] 在使用CHO细胞（人类SlP1受体在其中稳定地过表达）的基于细胞的钙荧光试验 中，通过化合物对SIPi受体相关的钙释放的影响，将化合物对SIPi受体的活化进行定量 (Flp-In系统，Invitrogen)。为了加强G蛋白偶合以及对Ca 2+释放直接发信号，过表达的受体 还具有修饰的G蛋白（Gai4qi4)的C端序列（W0 02/04665)。在荧光成像读板仪（FI ipR， Molecular Dynamics)中，对钙敏感染料flu〇-4(Invitrogen)进行焚光测定，测定胞内钙的 变化。
[0148] 在实验之前大约18-24小时，将稳定地过表达人类SlP1受体的CHO细胞播种(每孔 40.000个）在黑色透明底的聚-D-赖氨酸涂渍的96孔板（Becton Dickinson ,Biocoat celIware)中。在37°C、含有5 %二氧化碳和95%湿度的培养箱中，使细胞生长在细胞培养基 中，这种培养基基于F_12glutamax培养基(Gibco#31765)，补充有l%(vol/vol)青霉素/链 霉素（？41#?06-07100)、10%(￥〇1八〇1)胎牛血清卬03 ;取(：1〇116炭/葡聚糖处理的？83# SH30068)和均霉素B( Invitrogen，#10687-010)，最后浓度为300mg/L。
[0149] 在Fl ipR实验之前，在37°C、含有5 %二氧化碳和95 %湿度的培养箱中，在由Hanks ' 平衡盐液(HBSS;Invitrogen#14065049)(补充有:flu〇-4AM:2yM(给出的所有数据都是最后 浓度）；PjlHOnic?F-127:0 · 05% (vol/vol)(Invitrogen，#P-3000MP);HEPES: 20mM(Gibco# 15630);本尼米德:2.5mM(Sigma#P-8761);牛血清白蛋白（BSA) :0.05% (Sigma#A-6003)，用 氢氧化钠调节至PH7.5)组成的染料荷载缓冲液中，将细胞与fluo-4乙酰氧基甲基酯(^11〇-4AM，Invitrogen，#F14202) -起荷载60分钟。在细胞荷载期间，胞内酯酶使f lu〇-4AM裂解， 导致在细胞内捕集染料fluo-4。在细胞洗涤器(Tecan Power洗涤器）中，用先前列举的缓冲 液洗涤细胞三次，但不用fluo_4AM和BSA，使荷载终止。后面这种缓冲液在随后的细胞荧光 测定中也用作缓冲液。
[0150] 然后，用相应的各种浓度的化合物刺激经过染料荷载和洗涤的细胞，以DMSO溶液 (DMS0的最大最终浓度为0.3%V〇1/ V〇1)形式加入相应的化合物，或用唯一相应浓度的SlP (最终浓度IOOnM)(在DMSO中）刺激（阳性对照）。激活SlP受体的化合物引起胞内钙从内部储 备中释放出来，导致fluo-4荧光信号极大地暂时升高，对其监测大约3分钟。与对SlP阳性对 照的最大荧光响应相比较，由最大荧光响应来测定由试验化合物所引起的百分比活化。用 基线荧光值校正所有的荧光值，由预先只用DMSO培养的并且没有用SlP处理的细胞获得基 线荧光值(基线对照）。一式三份地进行所有测定。由各种浓度的活化，计算EC 5Q值。
[0151] 2 .Chem 细胞
[0152] GPCRPlOfi丨er?试验(源于Mi Ilipore)用于测定化合物A、BAF-312和芬戈莫德对 于SlP1、SlP2、SlP 3、SlP4或SlP5受体的EC5()活性。这些试验使用ChemiScreenGPCR稳定的细 胞系。
[0153] 3.HSC
[0154] 将人类HSC(Sciencel I)播种在96孔多孔板中，lOOyL/孔，每孔25xl03个细胞，并在 含有1 %补充物（Sciencell SC5352)和2%FCS的完全培养基（Sciencell SC5301)中附着24 小时。用含有2%FCS但不含补充物的Sciencell培养基替换培养基，另外培养24小时。洗涤 细胞，并放入 1〇〇μL试验缓冲液(HBSS，0.8mM MgS〇4,20mM Hepes，3.3mM Na2C〇3，lmM CaCl2， 10 %BSA)中。在pluronic酸的存在下，在暗处，在37°C，将细胞与Fluo4-AM-起荷载I小时。 除去荷载培养基，并用200yL/孔的试验缓冲液替换。在室温下，在暗处，使细胞稳定20分钟。 将培养板放置在FlipR装置中，加入50μ1体积（5Χ溶液，最后浓度ΙΟμΜ)的化合物A或MF-312,连续地记录钙荧光6分钟。对于灵敏度降低实验，首先注入化合物A或BAF-312之后，将 培养板洗涤一次，并在试验缓冲液中恢复1或3小时，而后，第二次加入化合物A或BAF-312。 对于对照实验，用试验缓冲液替换首先注入的化合物A或BAF-312，第二次注入的化合物A或 BAF-312作为参比。结果用荧光单位(FU)来表示。
[0155] b)f3_抑制蛋白试验
[0156] 源于Di sCOverX的PathHUilterX β-抑制蛋白试验用于测定化合物A、BAF-312和芬 戈莫德对SlPl、SlP2、SlP3、SlP4或SlP 5受体的EC5()活性。在含有0.5%FBS的试验培养基中检 验化合物。
[0157] c)GTPy S试验
[0158] W02011/086079 描述了该方法。
[0159] d)内化作用试验
[0160] 源于DisCoverX的PathHunter?激活GPCR内化作用试验用于测定化合物A、BAF-312和芬戈莫德对SlP 1受体的EC50活性。在含有0.5%FBS的试验培养基中检验化合物。
[0161] e)利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和HUVEC的cAMP试验
[0162] I. CHO 细胞
[0163] 源于DiscoverX的HitHuni啟⑩cAMP试验用于测定化合物A、BAF-312和芬戈莫德 对SlP 1受体的EC50活性。在含有0.5 %FBS的试验培养基中检验化合物。
[0164] 2. HUVEC(人类脐带静脉内皮细胞）
[0165] 在毛喉素(Forskolin)处理的HUVEC细胞中，通过cAMPHTRF?试剂盒(Cisbio)的 方法，评价环化AMP对化合物A、BAF-312或芬戈莫德的响应。简要地说，将HUVEC( Lonza)播种 在白色96孔多孔板(半体积）中的EGM2培养基(Lonza)中24小时，每孔5x103个细胞。在实验 开始时，用存在于HBSS中的试验缓冲液替换EGM2培养基，HBSS含有Hepes (IOmM)、BSA (0 · 1 % )和ΙΒΜΧ(0 · 5mM)。将细胞恢复15分钟。将化合物A、BAF-312或芬戈莫德（10ηΜ-100μΜ) 加入到细胞中15分钟，而后加入毛喉素(forskolin) (FSLlOyM)t3FSK处理45分钟之后，加入 MAb抗cAMP穴合物和cAMP-D2 1小时，使反应终止。在培养结束时，读取荧光（Envision， Perkin Elmer)，并按照试验试剂盒方案计算FRET比例。按照逻辑斯谏（logistic)方程模 型，使用Sanof i BI0ST0T-SPEED软件，计算化合物A、BAF-312或芬戈莫德的效能(EC5q值）。
[0166] f)在RPTEC细胞试验中的Akt和ERKv2磷酸化(在基线条件下，或在衣霉素刺激之 后）
[0167] 将RPTEC细胞(Lonza)播种在白色6孔多孔板中的完全REBM/REGM培养基(Lonza)中 24小时，每孔0.3xl06个细胞，每孔2mL。在900yL静态培养基中，用血清使细胞额外饥饿24小 时。在37 °C，在I OOyL体积下，将高浓度的化合物A (I OX)加入到每个孔中，保持IO分钟。当使 用时，在加入化合物A之前30分钟，加入衣霉素（100μΙ)。除去培养基之后，用冷的PBS冲洗细 胞，并在冰上、在含有1 % tri ton、蛋白酶和磷酸酶抑制剂的IOOyL冷的RIPA缓冲液中溶解。 为了进行蛋白质印迹，将30yg总蛋白溶解产物装填到4-12%bis-tris凝胶（Invitrogen) 中。在迀移和转移之后，用抗磷酸Akt(Phospho-S