e .m.。*吨〈0.01，相对于基线。（图3-D):在Fischer大 鼠中，AKI保护和淋巴细胞减少之间的关系。注释:方框表示3mg/kg的化合物没有造成淋巴 细胞减少，并且具有充分的AKI保护作用，而BAF-312是淋巴细胞减少性的，并且显示部分的 AKI保护作用。
[0090] 图4:C57B16/J小鼠中的外周血单核细胞
[0091 ] P. O.给予1、3、10和30mg/kg的化合物A(n = 8)。用总白血球的百分比来表示每个时 点的血液淋巴细胞，并且说明平均+/-S.e.m.，***p〈0.001，相对于基线。
[0092]图5:小猎犬中的外周血单核细胞
[0093] 获取基线淋巴细胞数，而后给予狗3、10和30mg/kg(n = 8)单一口服剂量的化合物 A，或10mg/kg(n = 4)的BAF-312。监测动物7天（图5-A)，在BAF-312的情况下，监测至多66天 (图5-B)。*p〈0 · 05; #p〈0 · 01; *#p〈0 · 001，相对于基线。条形图是平均+/-S · e · m。注释:对于 3mg/kg剂量，在任何时点测定，化合物A不会引起任何明显的淋巴细胞减少。
[0094]图6:健康C57B16/J小鼠和F is cher大鼠中的肺血管渗漏
[0095]用化合物A(3和lOmg/kg，p · ο ·，b · i · d ·)、BAF_312( 1和 3mg/kg，p · 〇·，b.i.d.)和芬 戈莫德(0.1和lmg/kg，p.o.，b.i.d.)(n = 5-8)治疗小鼠7天。（图6-A):使用Evan's蓝溢出方 法，评价血管渗透性。（图6-B)肺重量。用化合物A( I、3、10、30和lOOmg/kg，p. ο.，b. i . d.)和 BAF-312(0·03、0·l、0·3、3和30mg/kg，p·o·，b·i·d·)治疗大鼠 7天。（图6-C):使用Evan's蓝 溢出方法，评价血管渗透性。*P〈〇 · 05; #p〈0 · 01; *#p〈0 · 001，相对于对照组（没有化合物） (对于小鼠）或载体（甲基纤维素，0.6%-tween 80,0.5%，在水中）（对于大鼠）。条形图是平 均+/-S·e.mo
[0096]图7:使用阻抗试验，SlP1受体在人类表皮微血管内皮细胞(HDMEC)上的灵敏度降 低（desensitization)
[0097] 用SlP(IyM)、芬戈莫德（IOOnM)或化合物Α(1μΜ)第一次刺激HDMEC 1小时，而后进 行30分钟的清除期。使用S1P(3个浓度)的第二次刺激，并测定所得的阻抗(η = 3次实验），评 价第一次刺激对受体灵敏度降低的影响。所有第一次刺激的浓度大于EC9Q。条形图是平均 +/-S.e.m〇
[0098] 图8:使用阻抗试验，SlP1受体在人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)上的灵敏度降低 [0099]用SlP(IyM)、化合物Α(1μΜ)、芬戈莫德（IOOnM)或SEW2871(lyM)第一次刺激HUVEC 1小时，而后进行30分钟的清除期。使用S1P(4个浓度）的第二次刺激，并测定所得的阻抗(η =3次实验），评价第一次刺激对受体灵敏度降低的影响。所有第一次刺激的浓度大于EC 90。 条形图是平均+/_s. e .m。
[0100]图9:使用FlipR试验，SlP1受体在过表达SlPKG-融合)的CHO细胞上的灵敏度降低 [0101](图9-A):该方案包括：用SlP(IOOnM)、指定浓度的化合物A、芬戈莫德、BAF-312、 ponesimod进行第一次刺激5分钟。选择所有第一次刺激的浓度大于EC%。改变清除期之后， 用SlP(IOOnM)进行第二次刺激，评价受体灵敏度降低。（图9-B):对于改变清除期（15至60分 钟，n = 4次实验）的每个化合物而言，表现出了 SlP引起的FlipR响应，用基础响应的百分比 表不。条形图是平均+/_s · e.m。
[0102]图10:使用FlipR试验，SlP1受体在人类肝脏星形细胞(HSC)上的灵敏度降低 [0103](图10-A):该方案包括：用化合物Α(10μΜ)或BAF-312(300nM)进行第一次刺激。选 择所有第一次刺激的浓度大于EC90。经过1小时或3小时清除期之后，使用相同化合物进行第 二次刺激，评价受体灵敏度降低。（图10-B):对于改变清除期的每个化合物而言，表现出了 化合物A或BAF-312引起的FlipR响应，用荧光单位表示(n = 3次实验）。条形图是平均+/-s.e.m〇
[0104] 图11:在C57B16/J小鼠中，I/R损伤之后的血浆SlP的时程
[0105] 在假手术之后，或在双侧肾动脉封闭而后进行再灌注之后22分钟，评价血浆SlP水 平(Elisa试剂盒，从Echelon获得）。对照组(CTRL)不进行手术。###p〈0.001，相对于假手术 组(时间-配对）。邙〈〇. 05;#p〈0.001;*#p〈0.001，相对于对照组(CTRL)。条形图是平均+/-s.e.m〇
[0106] 方法 [0107]原料:
[0108] 商购芬戈莫德和SEW2871。按照公开的方法，合成BAF-312和ponesimod:
[0109] · BAF-312：W004/103306,
[0110] · ponesimod：W005/054215〇
[0111] 按照W02011/086079文献所描述的方法，合成化合物A。
[0112] 按照European Community Standards on the Careand Use of Laboratory Animals，并且经Animal Careand Use Committee of Sanofi Research&Development的批 准，进行所有的体内研究。
[0113] 统计分析:
[0114] 为了评价所评定参数的差异，基于正态分布和方差的同质性(Levene试验），使用 Student检验或WiIcoxon检验，比较假手术/对照组与载体治疗组。然后，使用EverstOt V6 软件，进行单向方差分析(ANOVA)或双向方差分析，比较载体治疗组与化合物治疗组。当合 适的时候，在这种初始分析之后，进行Dunnett事后检定。在非方差同质性的情况下，使用 Kruskal-Wal I is检验。如果p〈0.05,则认为在各组之间的差异是显著性的。
[0115] 1.心血管功能安全性
[0116] a)hERG 试验
[0117] 按照下列方案，培养表达人类ERG(ether-a-g〇-g 〇相关基因）钾通道的重组CHO(中 国仓鼠卵巢)细胞系（Cytomyx目录编号：CYL3002)。必要时，用冷冻的等分样品重新开始培 养。将冷冻细胞的等分样品（ImL)快速升温至37°C，并首先重新涂覆在75cm 2烧瓶(Corning) 中。然后，使用含有10%胎牛血清的α_极限必需培养基(Gibco 32571-028)，将体积调节至 10mL。24小时之后，将培养基更新，为了防止细胞衍生，加入1 %遗传霉素（G418，Gibco 10131)。两或三天之后，将细胞播种在T25烧瓶中，1.5xIO6个细胞。将烧瓶放置在37 °C、含有 5 % CO2的培养箱中1小时;而后，将它们放置在28 °C、含有5 % CO2的培养箱中2天。在28 °C培养 2天之后，进行细胞分离。用Accumax( Sigma; 1:4)或Versene(Gibco)收集细胞，并放入胞外 培养基中。
[0118] 使用胞外溶液卩厶丁01(似(：1，138111]\1;1((：1，4111]\^&(：12，1.8111]\1 ;]\^(：12，1111]\1;葡萄糖， 5.6mM;HETOS，IOmM)，使细胞过融合。用NaOH将pH值调节至7.3。将渗透摩尔浓度调节至 285m0sm。内部溶液制备如下：KCl，60mM ;KF，70mM;NaCl，15mM;HEPES，5mM;EGTA(K)，5mM;用 KOH将pH值调节至7.25。将渗透摩尔浓度调节至290m0sm。
[0119] 由于对从-SOmV钳制电位至+20mV检验电位的电位阶跃（2s)的响应，而后再极化 至-1 OOmV，hERG电流被激活。以20 s的间隔时间施加电位阶跃。在-1 OOmV下，以拖尾去活化电 流的形式测定hERG电流。基线测定3分钟之后，测定溶液改变之后4-6分钟的化合物A的效 果。在每个实验的最后，使特异性hERG阻断剂（即，利培酮(Risperidone)，其显示出大约0.7 μΜ的IC 5q值)过融合，测定hERG的100 %抑制。
[0120] 使用数据库和分析软件DataXpress 1 · 0(Axon Instruments/Molecular Devices)，分析电流。由基线测量时间外推出电流的线性衰减，药物影响之后的hERG电流抑 制的百分比计算如下：
[0121 ] hERG电流抑制的百分比（％ ) = 100_[ ((I-I稍·)/(I繊-I稍·) )x 100]。
[0122] 其中，"Γ是药物影响之后所测定的电流，"I?棚"是特异性hERG阻断剂影响之后所 测定的电流，"Iss"是在药物过融合之前测定的电流。
[0123] b)兔浦肯野纤维试验
[0124] 利用分离出的兔浦肯野纤维(雄性，新西兰兔子；1.3至1.5kg;9_12周大），通过微 电极技术，评定化合物A对所记录的静止膜电位和作用电位参数的影响。测定下列参数:静 止电位(RP，mV)、作用电位幅度(APA，mV)、作用电位升高的最大速度(Vmax，V/s)、再极化50和 90%时的作用电位时间（APD 5q和APD9q，ms)。在36 ± 1°C下，将纤维与氧合生理溶液过融合， 该生理溶液含有(mm〇l/L): NaCl: 120; KCl: 4;MgCl2:1; NaH2PO4:1 · 8; NaHCO3:25;葡萄糖：11; CaCl2:1.8; pH = 7.4。首先，将化合物A溶解到DMSO中，获得12mmol/L的储备溶液。将此溶液 进一步稀释到DMSO中，而后，加入到该生理溶液中，获得合适的额定浓度:0.3、1、3、10和30μ mo I /L (即，活性成分分别为0.1、0.5、1.4、4.5和13.6yg/mL)。在生理溶液中，试验制剂中的 DMSO的最终浓度保持0.25% (v/v)不变。首先，用生理溶液将浦肯野纤维(n = 4)过融合。经 过30分钟控制时间之后，评价试验化合物，每30分钟顺序升高浓度。对于每个试验浓度，在 每秒1个脉冲（IHz)的基础速率刺激纤维。此外，刺激速率从每秒1个脉冲（IHz)减小至每4秒 1个脉冲(0.25Hz)，持续3分钟，再次升高至每秒1个脉冲，持续1分钟，最后升至每秒3个脉冲 (3Hz)，再持续2分钟(在第19和第25分钟之间），如下所述：
[0126] 使用低刺激速率，能够在作用电位的再极化阶段期间有利于出现异常电学状况， 并且促进形成早期后去极化(EADs)。高刺激速率用于评价使用-依赖性钠通道阻断状况。达 到最高浓度之后，将生理溶液再次过融合，评价药物影响的可逆性(廓清）。
[0127] c)狗遥测研究
[0128] 该研究的目的是：利用有意识的遥测狗，给药后经过24小时时间，评价化合物A对 心血管功能(血压、心率和ECG)的电位影响。
[0129] 使有意识的自由活动的狗(]\&^81^11?31'1118，11 = 4,2个雄性，2个雌性，体重6.9至 10.8kg，44至64个月大）接受口服或静脉内剂量的阴性对照物（即，对于口服途径，接受 0.5% (w/w)羟乙基纤维素水溶液，或20%Captisol的水溶液(pH7.5至8))，而后，按照剂量 升高研究设计，对于口服途径，接受30和100mg/kg的化合物A的阴性对照物悬浮液，或对于 静脉内途径，接受10和30mg/kg的化合物A的阴性对照物溶液，在每次给药（口服途径:5mL/ kg;或用30分钟输入到颈静脉中）之间，廓清时间至少4天。在每个治疗天，从给药之前大约2 小时至给药之后24小时，连续地记录动脉血压和lead II ECG信号（传感器，从Data ScienCe，USA获得）。在几个时点处，分析下列参数:动脉血压(收缩期、舒张期和平均值）、心 率、RR的心电图参数、PQ (= PR )、QT间隔时间和QRS综合波持续时间以及体温。按照 Fridericia' s和van de Water ' s公式，校正心率变化的QT间隔时间。给药后30分钟至6小 时，检验任何心律紊乱的心跳与心跳间的全部ECG信号，以及波形的形态。在每个治疗天，进 行临床观察。评述显像记录，确定电位特性的改变和电位对心血管参数的干扰。给药之后， 分析时点如下:0.5、1、2、3、4、6、8、12、16和24小时。
[0130] 2.内皮屏障完整性的分化
[0131] a)小鼠肺血管渗漏研究
[0132] 用3和10mg/kg的化合物A、1和3mg/kg的BAF-312、0.1和lmg/kg的芬戈莫德或载体 (O · 6 %甲基纤维素 -ο · 5 % tween 80，在水中）治疗雄性C