化合物，可以使用例如组织提取 物、基因文库的表达产物、合成化合物、合成多肽、天然化合物等，但是用于筛选的测试化合 物并不限于这些。
[0091] 本发明第七个方面涉及特异性识别由本发明第一个方面的肝癌预后标记物编码 的蛋白的抗体。
[0092] 特异性识别本发明的第一个方面的肝癌预后标记物的抗体是特异性检测肝癌预 后标记物所编码的蛋白的存在水平或存在模式的代表性物质，因而能够有效地用于评估肝 癌预后。此外，根据情况，所述抗体可以特异性促进或抑制在肝癌的发生或发展中起重要作 用的蛋白的活性，因而能够用作用于肝癌的治疗剂。
[0093]由于已经找到本发明的第一个方面的肝癌预后标记物，通过使用本领域广泛知晓 的技术能够容易地进行所述肝癌预后标记物所编码的蛋白的多克隆抗体、单克隆抗体以及 重组抗体的制备。
[0094] 通过本领域广泛知晓的将本发明的第一个方面的肝癌预后标记物所编码的蛋白 注射进动物体内，并从动物身上采血以获得包含抗体的血清的方法，能够制备多克隆抗体。 这些多克隆抗体能够从各种动物宿主中制备，例如山羊、兔、绵羊、猴、马、猪、牛、狗等，且制 备方法是本领域公知的。
[0095] 单克隆抗体可以通过使用杂交瘤方法[Kohler和Mil stein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519]或·菌体抗体文库技术[Clackson等，Nature,352: 624-628，1991 ;Marks等，J.Mol .Biol.，222:58，1-597，1991 ]等本领域广泛知晓的方法来制 备。通常，杂交瘤方法使用从免疫学上适合的宿主动物例如小鼠获得的细胞和作为另一群 体的癌症或骨髓瘤细胞系，所述动物已注入本发明的第一个方面的肝癌预后标记物所编码 的蛋白抗原。从两个群体中所获得的组织通过如聚乙二醇等本领域广泛知晓的方法来融 合，然后以标准组织培养方法来使抗体生成细胞增殖。根据有限稀释技术通过亚克隆获得 同质细胞群后，按照已知技术在体内或体外大量地培养能够产生所需抗体的杂交瘤。噬菌 体抗体文库方法是这样一种制备单克隆抗体的方法:获得所需抗体的基因，在噬菌体表面 上以融合蛋白的形式表达该基因，从而在体外产生抗体文库，并从该文库中分离单克隆抗 体。通过以上方法制备的单克隆抗体可以通过使用例如凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换 层析、亲和层析等已知方法来分离。
[0096] 本发明第七个方面的抗体除了包含两条全长轻链和两条全长重链的完美形状之 外，还包含抗体分子的功能片段。所述抗体分子的功能片段是指具有抗原结合功能的片段， 包括Fab、F(ab'）、F(ab'）2、Fv等等。
[0097] 发明效果
[0098] 根据本发明，提供了一种肝癌预后标记物;一种用于评估肝癌预后的组合物，该组 合物包含能够检测到所述肝癌预后标记物的表达水平的变化的物质;一种用于评估肝癌预 后的试剂盒，所述试剂盒包含所述用于评估肝癌预后的组合物;一种使用所述肝癌预后标 记物进行肝癌预后评估的方法；以及一种使用所述肝癌预后标记物筛选肝癌治疗剂的方 法。
[0099] 所述肝癌预后标记物能够有效地用于肝癌患者中的简单且正确的预后评估。此 外，所述标记物的生理学功能可直接与肝癌的发生或发展有关。因而，该标记物能够有效用 于肝癌的发生或发展机制的研究，或用作开发肝癌治疗剂的靶标。
[0100]上述肝癌预后标记物是那些更显著的、临床高度有用的、且能够更准确地预测肝 癌预后评估的标记物，这是因为它们是通过对取自空前的多位患者的肝癌组织进行统计学 分析而发现的。
【附图说明】
[0101] 图1至图10是通过测定所述肝癌预后标记物在复发、总生存和无病生存方面示出 的 Kaplan-Meier 曲线。
【具体实施方式】
[0102] 下面会通过实施方式详细阐述本发明；然而，描述所述实施方式仅仅是为了帮助 理解本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
[0103] 实施例
[0104] 实施例1:RNA的提取和CDNA的合成
[0105]获得取自120位已诊断为肝癌已经发生并且肝癌的发展已经得到确认的肝癌患者 的肝癌组织和相邻的正常组织。根据下面的方法提取各份组织的RNA并进行cDNA的合成。 [010 6] 根据产品说明书，使用RNeasy Minikit(Qiagen,德国）从肝癌组织和相邻的正常 组织中提取总RNA。使用Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies,美国）对获得的RNA提 取物中的总RNA称量。在提取的步骤中进行DNase I的处理以从RNA提取物中除去污染的基 因组DNA。含有4yg总RNA的样品与2μ1的ΙμΜ的d(T)18引物(Genotech，Korea)在70°C温育7分 钟并在冰上冷却5分钟。单独制备酶混合物[通过添加2μ1 0. 1M的DTT(Duchefa， Netherlands)、2μ1 的 10 X 逆转录缓冲液、5μ1 2mM的dNTP、lyl 200υ/μ1 的MMLV逆转录酶和 1 μL的40υ/μ1 RNA酶抑制剂(Enzynomics，Korea)至总体积为11μ1]。将该酶混合物添加至含 有RNA的样品中后，将其在42°C温育90分钟，然后在80 °C温育10分钟来使逆转录酶失活。通 过添加焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水使上述样品的终体积为400μ1。
[0107] 实施例2:定量实时RCR
[0108] 根据产品手册，使用PRISM 7900HT(Applied Biosystems，美国）对实施例1中获得 的每一个cDNA样品的下面两个基因标记物实施定量实时RCR扩增：
[0109] CBS(胱硫醚β-合酶;NCBI GI:209862802;SEQ ID N0:79);和
[0110] NNMT(烟酰胺N-甲基转移酶;NCBI GI:62953139;SEQ ID N0:80)。
[0111 ]所述定量实时RCR分析在10μ1的总体积中进行，所述总体积包括5μ1的2 X Taqman 基因表达主引物(master mix) (Applied Biosystems，USA)、5μΜ正向和反向引物各ΙμL、ΙμL 的ΙμΜ探针(Genotech，Korea)和2μ1的cDNA(在对照组中为等量的水）。扩增以下述循环进 行:95 °C解离10分钟的步骤，然后是95 °C解离15秒的步骤，和60 °C合成1分钟的步骤。引物和 探针序列使用Primer Express 3.0(Applied Biosystems,美国）设计，且所有探针序列在 5 '端标有FAM，3 '端标有TAMRA。下面表1中的下列引物和探针是用于每种标记物的。
[0112] 表1
[0113]
[0114] F:正向引物
[0115] R:反向引物
[0116] P:探针
[0117] 每种标记物基因表达的测定都重复三次，然后通过与5种参照基因（B2M、GAPDH、 HMBS、HPRT1和SDHA)的平均表达相减来标准化。测定每种标记物的CT(达到阈值所需的循环 数），并计算A CT值(每种标记物的CT减去所述参照基因的平均CT)。按照2^eT来计算mRNA的 拷贝数。根据一系列稀释后的cDNA样品的同时扩增结果来构建标准曲线。
[0118] 实施例3:数据分析
[0119] 考虑到实施例2中获得的每种标记物的标准化的表达和提供肝癌组织的患者的进 展，完成了 Kaplan-Meier曲线，随后进行显著性分析。
[0120] 根据120位提供肝癌组织的患者的进展，对于复发、总生存以及无病生存的各自的 病例，所述患者以时期递升的次序列出。通过暴露于风险中的患者数量除生存者(或复发的 患者）的数量计算出中间生存率（interval survival rate)(或中间复发率（interval recurrence rate))。累积生存率(或累积复发率)是条件概率，其通过先前的累积生存率 (或累积复发率)乘以现在的中间复发率（中间复发率)来计算。以生存时间（或观察期)为横 轴并且以累积生存率(或累积复发率)为纵轴，通过阶梯函数来构建Kap lan-Me i er曲线。
[0121] 对于每种标记物，完成了关于复发、总生存和无病生存的Kaplan-Meier曲线。根据 实验确定的统计学显著基准将实施例2中测定的各标记物的表达划分为高表达和低表达， 并且对于各标记物，将高表达情况和低表达情况相互分开，从而完成Kaplan-Meier曲线。图 1示出了完成了的Kaplan-Meier曲线。
[0122] 由图1能够确定，在对于复发、总生存和无病生存完成的Kaplan-Meier曲线中，每 种标记物形成了高表达情况和低表达情况彼此明显区分的曲线。这意味着在各标记物表现 为高表达和低表达的情况之间，中间复发率或中间生存率和以此为基础的累积复发率或累 积生存率存在明显的差异，并意味着，因此每种标记物的表达模式可以是显示患者复发可 能性或生存可能性的指数。
[0123] 通过计算每一个复发点或死亡点的观察值和预期值获得卡方检验统计信息，对各 标记物或其组合通过log秩检验（log-rank test)进行显著性检验。从而计算出p值，下面的 表2显示了计算出的p值。
[0124] 表2
[0125]
[0126] 从上述表2可以确定，各标记物或其组合显示了足够低的p值，以至于能够认为对 于复发、总生存和无病生存全部具有显著性。特别是，在两种标记物组合的情况下，复发、总 生存和无病生存的所有P值均小于〇. 05，这是所希望的。当p值变得越低，统计学显著性就变 得越高。因此，低P值意味着通过各标记物或其组合对肝癌预后的评估是高度精确的。
[0127] 实施例4:另外的标记物的发现
[0128] 按照与实施例1至实施例3相同的方式进行了实验，不同之处在于以取自185位肝 癌患者的癌症组织和相邻的正常组织进行实验，从而通过使用下列基因作为标记物获得了 Kap lan-Me i er 曲线和p 值：
[0129] TKT(转酮醇酶；NCBI GI:205277461;SEQ ID N0:81)。
[0130] 下面的表3显示了所使用的引物和探针，图2显示了 Kaplan-Meier曲线；且下面的 表4显示了计算出的p值。
[0131] 表3
[0132]
[0133] F:正向引物
[0134] R:反向引物
[0135] P:探针
[0136] 表4
[0137]
[0138] 由图2可以看出，在对复发、总生存和无病生存而完成的Kapla