物能够在聚合试剂（即DNA聚合酶或逆转录酶)和四种不同 的三磷酸核苷以及温度存在的情况下启动DNA的合成。所述引物可以包含不改变在DNA合成 起始点起作用的引物的基本性质的其他碱基序列。可以使用公知的方法化学合成引物，且 可以使用相关领域中公知的多种方法来将核酸序列转化。
[0074] 本发明的第二个方面中的"能够特异性检测肝癌预后标记物的表达水平和/或表 达模式的物质"可以是在相应的肝癌预后标记物的表达水平或表达模式的分析方法中特异 性用于相应标记物的任何物质，或者是所述物质中至少两种的组合，并不限于用于RT-PCR 的引物。本发明的第二个方面的技术特性在于将被试肝癌患者的肝癌组织中的所述肝癌预 后标记物的表达水平或表达模式与标准水平比较，并检测差异。因而，任何能够检测这样差 异的物质可以被用作"能够特异性检测肝癌预后标记物的表达水平和/或表达模式的物 质"，并实现本发明的目标技术效果。而且，本领域的普通技术人员根据具体的实施方式参 照相关领域的公知常识能够选择并使用合适的物质。
[0075] 本发明的第三个方面涉及到用于评估肝癌预后的组合物，所述组合物包含有能够 特异性检测第一方面中的所述肝癌预后标记物所编码的蛋白的存在水平和/或存在模式的 物质。
[0076] 关于本发明的所述肝癌预后标记物的表达水平或表达模式，除了本发明的第二个 方面中的检测根据每一种标记物的mRNA的水平或模式的方法之外，还可以使用用于检测样 本中每一种标记物所编码的蛋白的存在水平或存在模式以估计每一种标记物的表达水平 或表达模式的方法。
[0077] 本发明中所述肝癌预后标记物所编码的蛋白的存在水平或存在模式的特异性检 测是指确定生物学样本中存在多少本发明中所述肝癌预后标记物所编码的蛋白和其以何 种模式存在的方法。例如，与所述肝癌预后标记物编码的蛋白特异结合的抗体能够用于确 定存在水平或存在模式的过程。本说明书中，"抗体"是指能够与抗原的表位特异结合的蛋 白，它是一个包含有多克隆抗体、单克隆抗体以及重组抗体的概念。
[0078] 对于使用抗体测定蛋白的存在水平或存在模式的方法，有蛋白质印迹、ELISA(酶 联免疫吸附测定）、放射免疫测定、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳 (rocket immunoelectrophoresis)、组织免疫染色、免疫沉淀测定、补体结合试验、FACS(焚 光活化细胞分类）、蛋白芯片等。但是，除上述以外，可以使用在相关领域中普遍采用的任何 方法。
[0079] 通过上述的分析方法，可以将被试肝癌患者的生物学样本中的抗原抗体复合物的 形成水平或形成模式与标准水平比较，且能够从中确定本发明的所述肝癌预后标记物所编 码的蛋白的存在水平或存在模式，并最终能够评估肝癌患者的预后。
[0080] 这里，"抗原抗体复合物"是指所述肝癌预后标记物所编码的蛋白和它的特异抗体 的复合物。一般通过检测与二抗偶联的检测标记信号的大小和模式来测定抗原抗体复合物 的形成水平或形成模式。这样的检测标记例如可以是酶、荧光物质、配体、发光物质、纳米粒 子、氧化还原分子、放射性同位素等等，但并不限于这些。当使用酶作为检测标记时，作为能 够使用的酶有葡糖醛酸糖苷酶(i3-glucul 〇nidaSe)、i3-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、 尿素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶、核糖 核酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨 酶、磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶、内酰胺酶等等，但所述酶并不限于这些。当使用荧光物质 作为检测标记时，作为能够使用的荧光物质有荧光素(fluorescein)、异硫氰酸盐、罗丹明、 藻红素、藻青素、别藻蓝素、邻苯二甲醛、荧光胺等，但所述荧光物质并不限于这些。当使用 配体作为检测标记时，作为能够使用的配体有生物素衍生物等等，但所述配体并不限于这 些。当使用发光物质作为检测标记时，作为能够使用的发光物质有吖啶酯、发光素 (luciferin)、发光素酶（luciferase)等，但所述发光物质并不限于这些。当使用纳米粒子 作为检测标记时，作为能够使用的纳米粒子有胶体金、着色胶乳(tinted latex)等等，但所 述纳米粒子并不限于这些。当使用氧化还原分子作为检测标记时，作为能够使用的氧化还 原分子有二茂铁、钌络合物、紫罗碱(viologen)、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1，4_苯醌、 氢醌、K4W(CN)8、[0s(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+、[M0(CN)8]4-等，但所述氧化还原分子并不 限于这些。当使用放射性同位素作为检测标记时，作为能够使用的放射性同位素有3H、14C、 32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I orl86Re等等，但所述放射性同位素 并不限于这些。
[0081] 在本发明的第三个方面中，"能够特异性检测所述肝癌预后标记物所编码的蛋白 的存在水平和/或存在模式的物质"可以是在检测所述肝癌预后标记物所编码的蛋白的存 在水平和/或存在模式的物质的分析方法中特异性用于所述标记物所编码蛋白的任何物 质，并不一定限于抗体。本发明的第三个方面的技术特征在于将取自肝癌患者的生物样品 中的所述肝癌预后标记物所编码的蛋白的存在水平或存在模式与基准比较，并检测差异。 因而，任何的物质均可以被用作"能够特异性检测肝癌预后标记物所编码的蛋白的存在水 平和/或存在模式的物质"并能实现本发明旨在达到的技术效果，只要该物质能够检测到这 样差异即可。本领域的普通技术人员基于本领域的一般常识和已知技术，根据具体实施方 式能够容易选择/拣选合适的物质。
[0082] 本发明的第四个方面涉及预测肝癌预后的试剂盒，所述试剂盒包含有本发明第二 或第三方面所述的用于预测肝癌预后的组合物。
[0083] 除了包含在用于评估肝癌预后的组合物中的能够特异性检测肝癌预后标记物的 表达水平和/或表达模式的物质，或能够特异性检测肝癌预后标记物所编码的蛋白的存在 水平和/或存在模式的物质，本发明中用于评估肝癌预后的试剂盒还可以包括适用于分析 基因的表达水平或表达方式的方法或分析蛋白的存在水平或存在模式的方法的一种或多 种其他成份、溶液或装置。例如，对于检测基因的表达水平或表达模式的诊断试剂盒，该诊 断试剂盒可以包括进行RT-PCR所需的基本成份，除了标记物基因的mRNA各自特异性的引物 外，该RT-PCR试剂盒根据具体的实施方式可以包括例如试管或其他适合的容器、反应缓冲 液、脱氧核苷酸(dNTPs)、酶例如Taq聚合酶和逆转录酶、DNA酶、RNA酶抑制剂、DEPC-水(DEPC 水）、无菌水、用作定量的对照组的基因特异性引物对等。同时，在诊断试剂盒用于检测蛋白 的存在水平或存在模式的情况下，该诊断试剂盒可以包括例如进行ELISA所需的基本成份。 该ELISA试剂盒可以包括能够检测结合抗体的组分，例如，标记的二抗、生色团、酶(例如与 抗体连接的酶)及其底物，和对定量对照组蛋白特异的抗体。进一步地，根据具体的实施方 式，该诊断试剂盒可以包括DNA微阵列或蛋白微阵列。
[0084] 本发明的第五个方面涉及一种用于肝癌预后评估的方法，该方法包括:步骤1，使 用第二方面的用于评估肝癌预后的组合物对取自被试肝癌患者的生物学样本进行处理;和 步骤2,通过将步骤1的处理结果与基准进行比较，检测权利要求1中的肝癌预后标记物的表 达水平和/或表达模式的差异。此外，发明的第五个方面涉及一种用于肝癌预后评估的方 法，该方法包括:步骤1，使用第三方面的用于评估肝癌预后的组合物处理取自肝癌患者的 生物学样本;和步骤2,通过将步骤1的处理结果与基准进行比较，检测权利要求1中的肝癌 预后标记物所编码的蛋白在存在水平和/或存在模式的差异。
[0085] 例如，对在肝癌预后良好的患者的肝癌组织中表达更多的肝癌预后标记物进行表 达水平差异检测时，如果来自被试肝癌患者的生物样本中该标记物的表达水平高于基准， 可以得知肝癌的预后相对较好。同时，例如对在肝癌预后差的患者的肝癌组织中表达更多 的肝癌预后标记物进行表达水平差异检测时，如果来自被试肝癌患者的生物样本中该标记 物的表达水平高于基准，可以得知肝癌的预后相对较差。
[0086] 同时，例如，对在肝癌预后良好的患者的肝癌组织中表达更多的肝癌预后标记物 所编码的蛋白进行存在水平差异检测时，如果来自被试肝癌患者的生物样本中该标记物所 编码的蛋白的存在水平高于基准，可以得知肝癌的预后相对较好。同时，例如在对肝癌预后 较差的患者的肝癌组织中表达更多的肝癌预后标记物所编码的蛋白进行存在水平差异检 测时，如果来自被试肝癌患者的生物样本中该标记物所编码的蛋白的存在水平高于基准， 可以得知肝癌的预后相对较差。
[0087] 本发明的第六个方面涉及使用本发明的第一个方面的肝癌预后标记物来筛选肝 癌治疗剂的方法。由于本发明的第一个方面的肝癌预后标记物根据肝癌患者的预后而显示 出表达模式的显著差异，它可以是直接参与和肝癌的发生或发展特别是预后有关的生理学 功能的基因。因此，该标记物所编码的蛋白能够有效地用做研究肝癌的发生或发展机制或 发明肝癌治疗剂的目标蛋白。即，本发明第一个方面所述肝癌预后标记物符合开发肝癌的 治疗剂的重要前提，并因此该使用该标记物来筛选肝癌治疗剂的方法也涵盖在本发明的保 护范围内。
[0088] 作为本发明的第六个方面的一个实例，提供了筛选肝癌的治疗剂的方法，所述方 法包括检测测试化合物是否能促进或抑制本发明的第一个方面的肝癌预后标记物的表达 的步骤。作为筛选治疗剂的方法，可以使用例如RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、RNA酶 保护实验、northern印记、DNA微阵列、SAGE[基因表达系列分析;Velculescu等，Science 270:484-7 ]、MPSS[大规模平行标记测序;Brenner等，PNAS · USA · 97，1665-1670 ]等。除了以 上方法外，如有必要可以使用本领域的各种已知方法。
[0089] 同时，作为本发明的第六个方面的另一个实例，提供了筛选肝癌的治疗剂的方法， 所述方法包括:步骤1，将测试化合物与本发明的第一个方面的肝癌预后标记物所编码的蛋 白结合;和步骤2,检测该测试化合物能否促进或抑制所述蛋白的生理学活性。作为筛选治 疗剂的方法，例如，可以使用将本发明的第一个方面的用于肝癌早期诊断的蛋白标记物固 定到亲和柱上并将其与样本接触来纯化样品的方法[Pandya等，Virus Res 87:135-143， 2002]，使用酵母双杂交系统、蛋白质印迹的方法，高通量筛选的方法[Aviezer等，J Biomol Screen 6:171 -7，2001 ]等。除了以上方法外，如有必要可以使用本领域的各种已知方法。
[0090] 在本发明的第六个方面中，作为用于筛选的测试