用的靶点[Nature. 1994Jun30; 369(6483): 756-8]。
[0028] LAMP1蛋白（溶酶体相关膜蛋白1)也称为⑶107a抗原。它是一种膜糖蛋白，且似乎 与癌细胞的扩散有关[J Biol Chem.l990May 5;265(13):7548-51]。
[0029] LC3蛋白（MAPI轻链3样蛋白1)是微管结合蛋白，它与微管与细胞骨架间的相互作 用有关。LC3蛋白是酵母ATG8的同源物，已知其能够通过多种自噬蛋白的作用与磷脂酰乙醇 胺结合并组成自噬小体[J Biol Chem.l994Apr 15;269(15):11492-7]〇
[0030] PRKAA1蛋白（AMP激活的蛋白激酶，催化性，α-l)是AMPK的催化亚基。该AMPK是起到 检测细胞内能量水平的作用的蛋白。已知它在当ΑΜΡ/ΑΤΡ比例增高时激活以限制各种生物 合成反应[FEBS Lett.l994Dec 12;356(1):117-21]。
[0031] PTEN蛋白（磷酸酶和张力蛋白同源物)已知是一种肿瘤抑制子，在多种类型的癌症 中失活。它既是一种蛋白磷酸酶同时也是一种磷脂酰肌醇_3,4,5_三磷酸3磷酸酶，已知其 能够破坏PI3K-AKT/PKB信号传递[Nat Genet.1997Apr; 15(4):356-62]。
[0032] ULK1蛋白（Unc-51样激酶1)是一种与轴突生长有关的丝氨酸/苏氨酸激酶，也称为 ATG1同源物。对于自噬作用而言，已知其能够被mTOR磷酸化[Genomics . 1998Jul 1; 51 (1): 76-85]〇
[0033] XIAP蛋白（X连锁凋亡蛋白抑制子)是IAP家族的一员，且在IAP中，它有强的细胞凋 亡抑制效果。已知其通过与肿瘤坏死因子受体关联因子TRAF1、TRAF2的结合抑制细胞凋亡 并抑制半胱天冬酶的活性[Nature. 1996Jan 25; 379(6563): 349-53]。
[0034]但是，还不清楚这些蛋白表达水平和表达模式在肝脏组织中如何具体变化，以及 如何使用这些蛋白评估肝癌预后。而且，迄今为止还没有使用蛋白或编码蛋白的基因作为 用于肝癌预后标记物的实例。
【发明内容】
[0035] 技术课题
[0036]本发明的一个目的是提供一种有关肝癌预后的生物标记物，以容易且精确地评估 肝癌患者的预后，和还提供一个开发用于肝癌的治疗剂的重要的起点。因而，本发明提供了 一种肝癌预后标记物;一种用于评估肝癌预后的组合物，该组合物包含能够检测所述肝癌 预后标记物的表达水平的变化的物质；一种用于评估肝癌预后的试剂盒，所述试剂盒包含 所述用于评估肝癌预后的组合物；一种使用所述肝癌预后标记物进行肝癌预后评估的方 法；以及一种使用所述肝癌预后标记物来筛选肝癌的治疗剂的方法。
[0037]技术方案
[0038] 本发明比较取自多位诊断为患有肝癌的患者的肝癌组织中的基因表达程度，并根 据每位患者的进展检测特异性大量或小量表达的基因，从而发现能够用于评估肝癌预后的 肝癌预后标记物。
[0039] 本发明的第一个方面涉及肝癌预后标记物，所述肝癌预后标记物包含选自由下列 基因组成的组中的一个或至少两个基因的组合：
[0040] CBS(胱硫醚β-合酶;NCBI GI:209862802;SEQ ID N0:79);
[0041] NNMT(烟酰胺N-甲基转移酶;NCBI GI:62953139;SEQ ID N0:80);
[0042] TKT(转酮醇酶；NCBI GI:205277461;SEQ ID N0:81);
[0043] AIFM1(线粒体相关的凋亡诱导因子 1;NCBI GI:22202627;SEQ ID N0:82);
[0044] AKTl(RAC-a丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶;NCBI GI:62241010;SEQ ID N0:83);
[0045] ATG3(自噬相关蛋白3;NCBI GI:34147490;SEQ ID N0:84);
[0046] ATG5(自噬相关蛋白5;NCBI GI :92859692;SEQ ID NO:85);
[0047] ATG7(自噬相关蛋白7;NCBI GI:222144225;SEQ ID N0:86);
[0048] ATG12(自噬相关蛋白 12;NCBI GI:38261968;SEQ ID N0:87);
[0049] BAX(凋亡调节因子BAX;NCBI GI:34335114;SEQ ID N0:88);
[0050] BCL2(凋亡调节因子Bcl-2;NCBI GI:72198188;SEQ ID N0:89);
[0051 ] BCL2L1(凋亡调节因子Bcl-X;NCBI GI:20336333;SEQ ID N0:90);
[0052] BNIP3(BCL2/腺病毒E1B 19kD相互作用蛋白3;NCBI GI:7669480;SEQ ID N0:91);
[0053] CASP8(半胱天冬酶8;NCBI GI:122056470;SEQ ID N0:92);
[0054] CSElL(Exportin-2；NCBI GI:29029558；SEQ ID N0:93)；
[0055] DIABL0(Diablo同源物，线粒体;NCBI GI :218505810;SEQ ID NO:94);
[0056] DRAM(损伤调节自噬调控蛋白；NCBI GI:110825977;SEQ ID N0:95);
[0057] E2F1(转录因子E2F1;NCBI GI:168480109;SEQ ID N0:96);
[0058] FAS(肿瘤坏死因子受体超家族成员6;NCBI GI:23510419;SEQ ID N0:97);
[0059] FRAP1(FKBP12-雷怕霉素复合物相关蛋白；NCBI GI:206725550;SEQ ID N0:98);
[0060] LAMP1(溶酶体相关膜糖蛋白 1;NCBI GI :112380627;SEQ ID NO:99);
[0061] LC3[MAP1LC3A](微管结合蛋白 1A/1B轻链3A;NCBI GI:31563519;SEQ ID NO: 100);
[0062] PRKAA1 (5'-AMP激活的蛋白激酶催化亚基a-l;NCBI GI :94557300 ; SEQ ID NO: 101)；
[0063] PTEN(磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3磷酸酶和双特异性的蛋白磷酸酶PTEN;NCBI 61:110224474；SEQ ID NO:102)；
[0064] ULK1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ULK1;NCBI GI:225637564;SEQ ID N0:103);和
[0065] XIAP(含杆状病毒IAP重复序列的蛋白4;NCBI GI:32528298;SEQ ID N0:104)。
[0066] 肝癌的预后可以从多个方面来评估。然而，典型地从复发的可能性、生存的可能性 以及无病生存的可能性等方面来确定。本说明书中所描述的研究通过下述方式进行:从多 位肝癌患者的肝癌组织中获取基因表达谱，总体考虑复发的可能性、生存的可能性以及无 病生存的可能性等方面以通过进行统计数据处理过程来检测在表达水平显著差异的基因， 并发现能够评估肝癌预后的标记物。
[0067] 在本说明书中，"肝癌预后标记物"是指一种基因标记物，它是用于评估肝癌发生 后患者具有好的或差的预后的标准。本发明中，在有着良好的预后的患者的肝癌组织内该 标记物的表达水平与通过实验预先确定的标准水平相比显著的高或低。尤其是，在本发明 中，该标记物具有显著低的P值，该值是基于有着良好的预后和较差的预后的患者的肝癌组 织中的表达差异计算的。优选，P值小于〇. 05。
[0068] 对于多位已知患有肝癌的患者的肝癌组织，本发明通过将有着良好的或较差的治 疗进展的患者的肝癌组织的基因表达谱与标准水平比较而进行分析。因此，如此确定的标 记物能够特异性区别有着良好的肝癌预后或较差的肝癌预后的患者，因而其能够有效地用 于肝癌预后的评估。而且，考虑到如此确定的标记物在有着特定预后的患者中的肝癌组织 中特异性大量表达或小量表达，该标记物的生理学功能有可能直接涉及有关肝癌的发生和 进展的生理学功能，尤其是肝癌的预后。因此，该标记物能够有效地用做肝癌的发生和进展 的研究中的靶标或用于肝癌的治疗剂的开发。
[0069] 特别地，在本发明的第一个方面中的肝癌预后标记物是基于空前的多位患者的肝 癌组织的统计分析而发现的。因而，与基于仅仅一些患者的肝癌组织的基因表达谱而发现 的关于肝癌的常规标记物相比，所述标记物有着较大的显著性，具有较高的临床利用价值， 且具有用于评估肝癌预后的更精确的评估力。
[0070] 本发明的第二个方面涉及用于评估肝癌预后的组合物，所述组合物包含有能够特 异性检测第一方面中所述的肝癌预后标记物的表达水平和/或表达模式的物质。
[0071] 这里，可以通过确定由相应基因转录产生的mRNA的水平或模式的一般生化分析方 法来检测每种肝癌预后标记物的表达水平或表达模式。像这样的用于确定mRNA的水平或模 式的分析方法有RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、RNA酶保护实验、Nor thern印记、DNA微 阵列等等。此外，可以使用在相关领域中通常使用的方法。
[0072] 通过上述的分析方法，能够将肝癌患者的生物学样本中的mRNA的水平或模式与标 准水平进行比较，并从中检测本发明的肝癌预后标记物的表达水平和/或表达模式的差异。 这使得能够评估肝癌患者的预后。在本说明书中，"生物学样本"是指能够检测到所述肝癌 预后标记物的表达水平或表达模式，或者由所述肝癌预后标记物所编码的蛋白的存在水平 或存在模式的分离自人体内细胞、组织等等。其可以例如是尿、血液、血浆、血清等，但不具 体仅限于这些。
[0073]用于通过RT-PCR测定mRNA的水平或模式的试剂盒包含有本发明的所述肝癌预后 标记物的mRNA的特异引物。在本说明书中，"引物"是指能够互补地与模板结合并使逆转录 酶或DNA聚合酶能够启动模板复制的具有自由3'羟基的核酸序列。引物是具有与特定基因 核酸序列互补的序列的核苷酸，可以使用长度约7bp~50bp、优选约10bp~30bp的引物。其 他的RT-PCR试剂盒根据具体的实施方式可以包括试管或其他适合的容器、反应缓冲液、脱 氧核苷酸(dNTP)、酶如Taq聚合酶和逆转录酶、DNA酶、RNA酶抑制剂、DEPC-水、无菌水等。在 合适的缓冲溶液中和温度下，引